近年来，基因治疗技术飞速发展，尤其是以CRISPR为代表的基因编辑技术的进步，让人类治愈遗传疾病成为可能。但是利用 CRISPR 系统进行基因编辑依赖于 DNA 双链断裂（DSB），这可能导致基因组意料之外的突变，甚至是染色体断裂等。
碱基编辑器（Base Editor）通过基因组 DNA 中的单核苷酸转换实现精确的基因校正，而无需产生DSB，从而克服了 CRISPR 系统的许多限制，然而脱靶效应和旁观者效应却阻碍了碱基编辑器在人类基因治疗中的安全应用。
近日，温州医科大学谷峰课题组、美国国立卫生研究院张金伟、中国科学院遗传与发育生物学研究所高彩霞合作在Molecular Therapy期刊发表了题为：A precise and efficient adenine base editor的研究论文。
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该研究开发了更精确的下一代腺嘌呤碱基编辑器（ABE），该碱基编辑器可以在保持足够的编辑效率的同时，最大化提升编辑精度。与当前可用的腺嘌呤碱基编辑器 NG-ABE8e 相比，这一新碱基编辑器可以大幅提升编辑安全性，在某些人类细胞中可将旁观者效应降低到之前的七分之一。
碱基编辑器会在必要的地方切割 DNA ，为核苷酸替换做准备。当它起作用时，碱基编辑器仅编辑给定的核苷酸。而当它对靶核苷酸相邻的核苷酸进行编辑，即发生旁观者编辑（bystander edit）时，会造成不希望看到的结果，即旁观者效应（bystander effect）。
此前，研究人员已经开发了一个基于 EGFP 变体系统的筛选系统，可以在多个位点同时测量 ABE 活性。ABE 介导的编辑可以恢复 EGFP 的全长表达，产生大量的荧光增强。通过流式细胞法（FCM）分析细胞荧光强度，即可定量检测ABE的编辑效率及旁观者效应。
在本项研究中，研究者利用这种方法对不同的 ABE 进行筛选，发现其中一种 ABE 变体不仅在A6目标位点表现出强大的编辑效率，还能大大减少了A12旁观者位点的编辑。
为了了解在A12观察到的编辑减少是某个特定位点的单一现象，还是代表整个编辑窗口的全面减少，他们测量了相邻位点的编辑情况。令人鼓舞的是，他们发现在A9和A11位点的旁观者编辑也减少了至少2-3倍，这表明该 ABE 变体的编辑精度发生了系统性变化。相比于原始的 NG-ABEmax ，这种 ABE 变体含有9个突变，因此研究人员将其称为 NG-ABE9e。
除了测试 EGFP 基因中的外源性序列外，研究者还选择了16个具有代表性的内源性基因组位点，并在多种人类细胞系中进行测试。研究发现 NG-ABE9e 在所有人类细胞系的所有测试位点上都显著降低了脱靶旁观者编辑的频率，在某些位点上的降幅甚至高达7倍以上。这表明减少旁观者编辑是 NG-ABE9e 的特有属性，在不同的基因组环境和细胞环境中都无法改变这一点。
新碱基编辑器在水稻中的编辑特性
为了探究 NG-ABE9e 优异的编辑特性是否适用于其他细胞宿主，研究人员利用 NG-ABE9e（PABE9e）对水稻中的9个基因组位点进行了编辑，并与多种高效的 ABE 变体进行了比较。
结果表明，与 PABEmax 和 PABE7.10 相比，PABE9e 显示出相当高的编辑效率。此外，与 PABE8e 相比，PABE9e 的整体编辑效率虽略有降低，但精确度却大幅提高，使旁观者编辑次数减少了五倍之多。
基于这些结果，研究者们总结道，NG-ABE9e 能够广泛适用于多个细胞宿主和类型，并表现出一致的内在能力，可以介导高精度、高效率的碱基编辑。
新碱基编辑器在人类基因疗法中的应用
ABE 是一种特别有用的碱基编辑器，因为它们逆转了最常见的致病点突变类型（C/G到T/A)，这种突变约占已知致病性但碱基突变的一半左右。
为了探明新碱基编辑器在实际应用中精确纠正人类致病突变的能力，研究人员在 HEK-293 细胞系中构建了常染色体显性遗传性视网膜色素变性（adRP）的疾病模型。
adRP 是由视网膜紫质（RHO）上的 T17M 突变引起的，会导致患者丧失视力。由于 adRP 是一种由功能获得性突变引起的常染色体显性疾病，直接逆转该突变有望成为治疗该疾病的有效治疗策略。
在该研究中，研究人员尝试利用 NG-ABE8e 或 NG-ABE9e 以及设计的 sgRNA，在细胞中引入 M17T 回复性突变，将 CAT 变为 CGT。他们发现 NG-ABE8e 和 NG-ABE9e 均能介导高效的碱基编辑，其编辑效率分别达到61%和58%。然而，NG-ABE9e 的 “完美编辑率”（正确纠正致病突变而不产生旁观者编辑的概率）达到了49%，而同一情况下的 NG-ABE8e 只能达到27%。也就是说NG-ABE9e 显著降低了旁观者效应，可使 “完美编辑率” 几乎翻倍。这些结果表明，相比于 NG-ABE8e，NG-ABE9e 可以更加精确、更加安全可靠地纠正人类致病突变。
此外，NG-ABE9e 的出现也表明，碱基编辑器的活性和特异性是可以分离的两个特征，可以分开独立设计。以此为基础，未来学者们有望在一个编辑器上实现许多个理想的特征，从而研发出完美的碱基编辑器。需要指出的是，本研究中所采用的优化 ABE 的策略也同样适用于 CBE（胞嘧啶碱基编辑器）和 CGBE（可实现C/G到G/C转化的碱基编辑器），有望帮助人们战胜多种遗传性疾病。
