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CRISPR-Cas系统介导的“基因编辑”前沿生物技术的开发与应用已引起了全世界的广泛关注，各种各样依赖于HR同源重组途径的基因编辑器已经能够实现DNA的精准插入或基因敲除，这不仅促进了生物医学的基础研究，同时为多种遗传疾病的治疗带来了巨大的临床应用前景。然而哺乳类动物细胞中对于长片段DNA（尤其是10kb以上）的精准插入（或删除）效率却非常低，这严重阻碍了CRISRP技术在大片段基因编辑时的操作可行性。
上海科技大学生命学院高冠军团队在Nucleic Acids Research期刊在线发表题为：Transcription-coupled donor DNA expression increases homologous recombination for efficient genome editing的研究论文。
该研究报道了一种名为“TEd”简单、高效的基因编辑方法（Transcription-coupled Editor，TEd转录耦合编辑器）。研究团队通过在传统HR-donor（HR-供体）上引入转录过程以改变DNA修复过程中的供体染色质结构状态来促进同源重组的发生，从而实现细胞内大片段DNA的高效编辑。该研究团队一直从事基因编辑技术的开发和应用，如GFP荧光标签的插入等。团队于2018年在细胞中融合表达Cas9与RT逆转录酶，然后通过在HR供体质粒上提供一个启动子以期能够转录与同源DNA互补的RNA分子，而后测试逆转录酶是否能够以RNA分子为模板直接合成相应的大片段，从而完成靶基因高效的knockin。随后的研究发现，此种依赖于RT逆转录酶的设计不能在大片段knockin上实现编辑效率的提升。然而，研究者却意外发现处于转录状态的HR-donor DNA能显著促进同源重组修复，团队据此提出通过人工引入转录过程以期改变DNA修复过程中的HR-供体的染色质结构状态，从而测试HR供体DNA结构状态的改变是否可以提高大片段DNA的插入效率。实验先后在哺乳类细胞的几个测试基因位点中均发现，处于转录耦合状态的供体DNA能够显著提高GFP的精准插入效率，团队将其命为转录偶联基因编辑器TEd。团队随后基于上述发现设计开发了一系列优化的TEd基因编辑系统，通过在同源供体DNA上引入启动子以形成TC-donor（Transcription-Coupled HR-donor），并在其转录产物TC-RNA的3’端添加多个MS2茎环结构以及在Cas9上融合MS2适配体的结合结构域（MCP），团队发现优化后的TEd系统在几种哺乳类细胞中的编辑效率相比于传统CRISPR-Cas9介导的编辑方法（CEd）均有更大幅度的提高（TEd方法对于GFP的精准插入可以达到传统方法CEd的10倍左右），并在高达10kb的DNA片段敲入方面也获得了很好的效果（传统CEd方法对于5kb片段靶向插入已非常困难）。不过，TEd方法的应用还受限于其TC-donor的转录方向。研究发现，TC-donor的转录方向对TEd编辑效率具有重要影响，仅当TC-donor的转录产物互补于对应gRNA的非靶向链时，TEd介导的基因编辑效率才相比经典CEd方法具有显著效率提升，这提醒研究者在后续实际应用中应当注意TEd系统的整体设计。
总而言之，该首次通过引入启动子改造HR-donor开发出了转录偶联新型基因编辑器TEd。通过一系列优化，TEd初步解决了传统CRISPR-Cas9介导的同源重组在大片段knockin效率低的问题。此外，TEd方法对于基因删除、取代、点突变较传统方法都有显著提高，这为TEd将来在临床治疗方面的应用奠定了基础。同时，团队大胆预测TEd转录偶联编辑器可能同样适用于其它物种。
