全球热文：张锋最新论文：CRISPR-Cas9的祖先IscB-ωRNA的结构和功能机制

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在过去十年里，基于CRISPR的基因编辑技术得到了快速发展，并被成功应用放到了人体临床试验中已治疗遗传疾病和癌症。与此同时，全世界的科学家们也在不断挖掘新的具有基因编辑潜力的新工具，以解决现有基因编辑工具尺寸太大、脱靶性等问题。2021年9月，张锋团队在Science期刊发表论文【1】，发现了一类广泛的转座子编码的RNA引导核酸酶，并将其命名为OMEGA系统（包括IscB、IsrB、Tnp8）。其中IscB可能是Cas9的祖先。该研究还发现，OMEGA系统使用一段RNA来指导切割DNA双链，即ωRNA。更重要的是，这些核酸酶很小，仅为Cas9的大约30%，这意味着它们可能更容易被递送到细胞中。对于OMEGA系统，张锋曾表示，对这些广泛存在的可编程核酸酶的发现感到非常兴奋，原来它们一直隐藏在我们鼻子底下。这些发现也提示了我们，还有更多的可编程核酸酶等待着发现和进一步开发。2022年11月7日，张锋、Hiroshi Nishimasu等人在Nature Communications期刊发表了题为：Structure of the IscB–ωRNA ribonucleoprotein complex, the likely ancestor of CRISPR-Cas9的研究论文【2】。该研究解析了IscB蛋白和和靶DNA的复合物的冷冻电镜结构，揭示了IscB -ωRNA核糖核蛋白复合体（RNP）的详细结构，从而展示了如此小的IscB蛋白是如何与ωRNA组装并介导RNA引导的DNA切割作用。具体来说，IscB蛋白尺寸很小，约400个氨基酸，而Cas9通常在1000-1400个氨基酸，这么小的IscB蛋白是如何与ωRNA组装并介导RNA引导的DNA切割作用的呢？通过冷冻电镜结构解析发现，IscB蛋白与Cas9具有相同的RucV和HNH内切酶结构域，而缺少了α-螺旋识别结构域（REC）。IscB与1个约200-400nt的非编码RNA（ωRNA）结合，从而实现对特定DNA序列的识别靶向和切割，其ωRNA要比Cas9的约100nt的向导RNA大得多。这种比较大的ωRNA骨架在结构和功能上补偿了IscB相对于Cas9所缺少的α-螺旋识别结构域（REC），并参与向导RNA对靶标DNA的识别，由于IscB保留了与Cas9相同的RucV和HNH内切酶结构域，因此，可以实现对靶标DNA的切割。IscB-ωRNA-靶标DNA复合体的整体结构这一发现为IscB-ωRNA复合物的DNA切割机制以及CRISPR-Cas9系统的进化提供了深刻的见解。值得一提的是，张锋、Hiroshi Nishimasu两人在11月3日，各自在Science期刊发表了解析Cas7-11的结构和作用机制的研究论文【3、4】。详情：Science：Cas7-11，一种可以切割蛋白质的CRISPR-Cas系统2022年5月，美国康奈尔大学可爱龙实验室在Science期刊发表论文【5】，解析了OMEGA系统中的IscB-ωRNA的结构及其切割DNA的机制。2022年10月12日，张锋团队在Nature期刊发表了题为：Structure of the OMEGA nickase IsrB in complex with ωRNA and target DNA的研究论文【2】。该研究解析了OMEGA系统中的IsrB-ωRNA和靶DNA的复合物的冷冻电镜结构。IsrB是IscB的缺少HNH核酸酶结构域的同系物，因此尺寸更小，仅有约350个氨基酸，这些系统结构的解析阐明了IsrB-ωRNA是如何共同识别并切割靶DNA的，也为进一步开发和工程化改造这一小型化核酸酶提供了基础。RNA引导的IsrB是转座子IS200/IS605超家族编码的OMEGA家族成员，从系统发育分析和共享的独特结构域来看，IscB是Cas9的祖先，而IsrB很可能是IscB的前身。与IscB和Cas9相比，IsrB缺少HNH内切酶结构域、α-螺旋识别结构域（REC）和大部分PAM序列相互作用域，因此，IsrB（仅约为350个氨基酸）要比Cas9（约1000-1400个氨基酸）小得多，也比IscB（约400个氨基酸）小。然而，IsrB较小的体积被一个相对较大的向导RNA所平衡（其ωRNA长约300nt）。张锋团队解析了来自湿热厌氧菌Desulfovirgula thermocuniculi的IsrB（DtIsrB）及其ωRNA和靶DNA的复合物的冷冻电镜结构。结构解析显示，IsrB蛋白的整体结构与Cas9蛋白共享一个骨架结构。但不同的是，Cas9使用α-螺旋识别结构域（REC）来促进对靶标的识别，而IsrB则依赖于它的ωRNA，ωRNA的一部分形成了一个复杂的三维结构，起到了类似于REC的作用。IsrB-ωRNA-靶标DNA复合体结构为了更好地理解IsrB和Cas9从RuvC进化过程中的结构变化，张锋团队比较了来自嗜热栖热菌（Thermusthermophilus）的RuvC（TtRuvC）、IsrB、CjCas9和SpCas9的与靶DNA结合的结构。RuvC-IsrB-Cas9的结构进化对IsrB及其ωRNA的结构分析，阐明了IsrB-ωRNA是如何共同识别并切割靶DNA的，也为进一步开发和工程化改造这一小型化核酸酶提供了基础。与其他RNA导向的系统的比较，突出了蛋白质和RNA之间的功能相互作用，促进了我们对这些不同系统的生物学和进化的理解。