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靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）免疫疗法已经在复发/难治性急性淋巴白血病（ALL）等恶性血液肿瘤的治疗中取得了令人惊喜的效果，多中心临床试验数据表明患者接受CAR-T治疗后的完全响应率可达70-90%。目前，美国 FDA已经批准了6款自体 CAR-T 细胞产品上市，用于治疗白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤等血液类癌症。大量的临床应用结果证明了这种个性化的疗法极具抗癌潜力，没有免疫排斥的风险，安全性也比较高，给全球众多癌症患者带来了希望。遗憾的是，随着随访时间的增长，有30-60%的病人在回输CAR-T 后一年以内复发。根据癌细胞表面抗原的表达情况，复发可分为 CD19 阴性和 CD19 阳性两大类，前者主要由癌症B 细胞CD19 表达丢失或下调导致，而后者的分子机制尚不清楚。2022年6月8日，耶鲁大学生物医学工程系樊荣教授团队与宾夕法尼亚大学J. Joseph Melenhorst、Pablo G. Camara团队合作，在Science Advances期刊发表了题为：Single-cell antigen-specific landscape of CAR T infusion product identifies determinants of CD19-positive relapse in patients with ALL的研究论文。该研究对从2012年在宾夕法尼亚大学医学院和费城儿童医院启动的全球首批临床试验中12名复发/难治性 B-ALL 病人的总计超过10万个回输前（Pre-infusion）4-1BB结构 CAR-T 细胞进行了单细胞精准分析，揭示了 Th2 功能在 CD19 阳性复发病人中的缺失。该结果进一步通过独立的流式分析和 IsoPlexis 分泌蛋白检测在49名病人的 CAR-T 功能特性表征中得到了验证。根据患者的临床反应，研究团队将12名患者分为长期完全缓解组（CR，超过54个月无复发，n=5），CD19 阳性复发组（RL，中位复发时间=9.6个月，n=5）和无响应组（NR，n=2），获取了 CAR-T 细胞在未激活、CD19 抗原特异性激活、T 细胞受体激活和非靶点激活条件下的全基因转录组和14种表面蛋白组信息。通过细胞因子共表达模块分析，研究团队首先发现在抗原特异性激活条件下， Type 2 （Th2）细胞集中分布在 CR 组 CAR-T 富集的区域，且 Th2 模块在 CR 组中的比例显著高于 RL 组。高度差异表达基因分析进一步识别到了 Th2 相关细胞因子IL4、IL5、IL13在 CR 组的上调和 Th2 pathway 的显著激活。接下来，对 CR 和 RL 病人 CAR-T 细胞集的聚类分析识别出8个具备独特转录组特征的亚群，其中亚群4中的细胞具有突出的 Th2 功能。通过细胞占比统计，发现 CR 组 CAR-T 在亚群4中的比例显著高于 RL 组。此外，从IL4、IL5、IL13以及主导 Th2 细胞分化的转录因子GATA3的单细胞表达分布点状图中可以看出，无论是表达水平还是表达频率，CR 组5名病人都明显高于 RL 组。为了验证上述发现，研究团队额外表征了49名 B-ALL 病人的 CAR-T 细胞，其中26名病人具备中位33.7个月的无复发完全响应，另外23名病人在中位9.3个月发生 CD19 阳性复发。双方研究人员独立开展了胞内流式分析（宾夕法尼亚大学）和 IsoPlexis 自动化分泌蛋白检测（耶鲁大学），两种方法共同证实了 Th2 功能在 RL 组中的缺失。该项研究通过细胞因子共表达模块、无监督学习聚类和经典信号通路分析从激活 CAR-T 的功能异质性中识别出了 Th2 功能在维持 CAR-T 长久缓解中的重要作用，揭示了当前 CAR-T 细胞免疫疗法领域十分关切的 CD19 阳性复发机制，为临床实践中预测响应和筛选病人提供了目标基因、明确了关键通路，也为提高 CAR-T 功效和改善治疗效果提供了理论基础。
