当下，免疫疗法正在肿瘤治疗领域掀起一场革命，但是仍有众多患者对免疫疗法没有良好应答。肿瘤相关巨噬细胞（TAM）是导致治疗抵抗的重要原因[1]。
TAM是肿瘤微环境（TME）中含量最丰富的免疫细胞，并且肿瘤中的TAM通常具有促进肿瘤发生发展的作用[2]。因此，清除TAM或许是一种能够改变TME免疫抑制性环境，促进抗肿瘤免疫应答的方法。但是前期开发的CSF1/CSF1R轴抑制剂在临床上效果不佳[3]，这提示我们仍要寻找更好的治疗策略。
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近期，由西奈山伊坎医学院Brian D. Brown和Miriam Merad领衔的研究团队，在《癌症免疫学研究》杂志发表研究成果[4]。他们发现，靶向F4/80的CAR-T不仅可以有效地清除TAM，解除TAM引起的免疫抑制，还可以增强肿瘤抗原特异性T细胞免疫应答，从而抑制多种肿瘤的生长。
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研究团队首先设计了靶向巨噬细胞表面特异性标志物——F4/80的CAR-T细胞（F4.CAR-T），随后将其与小鼠巨噬细胞或中性粒细胞共孵育，检测CAR-T对巨噬细胞的特异性杀伤能力。
结果表明，F4.CAR-T能够十分特异地杀伤巨噬细胞而不损伤中性粒细胞。接下来，他们在小鼠体内测试了F4.CAR-T对巨噬细胞的杀伤能力以及安全性，转输了F4.CAR-T的小鼠没有表现出应激或者治疗死亡案例，并且在转输CAR-T细胞12天后，小鼠脾脏中巨噬细胞的数量减少了80%。
这些数据表明，F4.CAR-T能够有效并且特异性地杀伤巨噬细胞。
F4.CAR-T可以有效地杀伤巨噬细胞
那么F4.CAR-T能否浸润至肿瘤中并清除TAM呢？
为了回答这个问题，研究团队构建了HKP1非小细胞肺癌小鼠模型，随后为小鼠转输了F4.CAR-T细胞，通过免疫荧光以及流式细胞术，他们发现，肿瘤内部浸润了大量的F4.CAR-T细胞，并伴随着TAM数量的显著减少。
这些数据表明，F4.CAR-T细胞能够有效浸润至肿瘤内部并杀伤TAM。
F4.CAR-T能够浸润至肿瘤内部杀伤TAM
F4.CAR-T能够减少TAM的数量，那么这可以减缓肿瘤进展吗？
研究团队观察了转输F4.CAR-T细胞的荷瘤小鼠的肿瘤负荷以及荷瘤生存期，发现与转输对照T细胞的小鼠相比，转输F4.CAR-T细胞的小鼠肿瘤体积更小，并且荷瘤生存期显著延长。
这些数据表明，转输F4.CAR-T细胞能够显著延缓肿瘤进展，延长小鼠的荷瘤生存期。
转输F4.CAR-T显著抑制肿瘤生长并延长生存期
在免疫荧光检查小鼠肿瘤组织时，研究团队注意到治疗组小鼠肿瘤细胞中荧光标志物tdTomato的表达水平有明显的下降。考虑到曾有研究表明，荧光蛋白GFP也可以作为一种肿瘤特异性抗原被荷瘤小鼠T细胞检测到，并且GFP的表达水平与MHC表达水平呈负相关关系[5]。他们猜想，tdTomato或许也能代表一种肿瘤特异性抗原，它的表达下降可能与MHC表达水平上升有关，进而使肿瘤更容易被免疫系统杀伤。
为了验证这个猜想，研究团队分析了肿瘤细胞上tdTomato荧光强度与MHC表达水平，发现相比于未转输F4.CAR-T的小鼠，转输F4.CAR-T细胞的小鼠其肿瘤细胞tdTomato荧光强度显著降低，但是MHCⅠ和MHCⅡ的表达显著上调。
肿瘤细胞中tdTomato的减少和MHC表达的增加与肿瘤负荷的降低相关，提示F4.CAR-T治疗可能促进内源性T细胞对tdTomato+肿瘤细胞的免疫应答。
为了检测内源性T细胞的应答，研究团队使用了四聚体技术检测识别荧光素酶优势表位（HKP1细胞表达这个表位）的CD8+T细胞，发现与未转输F4.CAR-T细胞的小鼠相比，接受F4.CAR-T细胞治疗的小鼠肿瘤中浸润了更多的荧光素酶特异性CD8+T细胞。
以上数据表明，使用F4.CAR-T细胞进行治疗不仅能够有效清除肿瘤内TAM，还能够增加内源性肿瘤特异性T细胞的数量，对肿瘤进行杀伤与免疫编辑（表现为tdTomato表达降低）。
F4.CAR-T细胞治疗激发内源性T细胞免疫应答
已有研究表明，HKP1肿瘤对PD-1抑制剂治疗敏感，那么F4.CAR-T细胞治疗的效果与PD-1抑制剂相比如何呢？两者是否会有协同作用？
为了探究上述问题，研究团队为荷瘤小鼠进行了PD-1抑制剂单药治疗、F4.CAR-T细胞单药治疗以及二者联合治疗。结果显示，PD-1抑制剂和F4.CAR-T细胞均能够抑制肿瘤生长，但是两者并无协同作用。这也表明，F4.CAR-T细胞和PD-1抑制剂都是通过增强内源性T细胞应答来增强抗肿瘤能力的。
F4.CAR-T细胞与PD-1抑制剂无协同作用
CD8+T细胞对靶细胞的杀伤依赖于靶细胞表面抗原肽:MHCI复合物的存在，已有的研究结果表明在转输F4.CAR-T细胞后肿瘤细胞上调表达MHCI，这可能是F4.CAR-T细胞促进内源性T细胞应答的重要机制，那么F4.CAR-T是如何促进肿瘤上调表达MHCⅠ的呢？
我们都知道，活化的CD8+T细胞可以产生大量的IFN-γ，而IFN-γ能够诱导MHCI的表达，因此研究人团队猜想或许是肿瘤中活化的F4.CAR-T细胞在杀伤TAM时释放的IFN-γ诱导肿瘤细胞上调表达MHCI。
为了证明这个猜想，研究团队构建了IFN-γ缺陷的F4.CAR-T细胞，并将其转输至荷瘤小鼠体内。结果显示，与转输WT F4.CAR-T细胞相比，转输Ifng-/-F4.CAR-T细胞后肿瘤细胞上MHCI的表达显著降低。这表明上述猜想是正确的。
F4.CAR-T细胞产生的IFN-γ诱导肿瘤细胞上调表达MHCI
最后，研究团队在两种富含巨噬细胞的肿瘤模型（ID8卵巢癌以及胰腺癌）中测试了F4.CAR-T细胞的治疗效果。结果显示，F4.CAR-T细胞对这两种恶性肿瘤均有治疗效果，显著地抑制了肿瘤的生长。
这些数据表明，F4.CAR-T细胞疗法在多种肿瘤中均有良好的治疗潜力。
F4.CAR-T对多种恶性肿瘤均有治疗效果
总而言之，这项研究成果从概念上验证了，靶向巨噬细胞表面F4/80的CAR-T细胞可以发挥良好的抗肿瘤作用。其机制包括清除具有免疫抑制作用的TAM；上调肿瘤细胞表面的MHC，促进内源性T细胞免疫应答。这个研究也为后续开发清除TAM的CAR-T疗法提供了支撑。
参考文献：
1. Mantovani A, Marchesi F, Malesci A, Laghi L, Allavena P. Tumour-associated macrophages as treatment targets in oncology. Nature Reviews Clinical Oncology. Nature Publishing Group; 2017;14:399–416.
2. Noy R, Pollard JW. Tumor-Associated Macrophages: From Mechanisms to Therapy. Immunity. Elsevier Inc.; 2014;41:49–61
3. Cannarile MA, Weisser M, Jacob W, Jegg A-MM, Ries CH, Rüttinger D. Colony-stimulating factor 1 receptor (CSF1R) inhibitors in cancer therapy. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. Journal for ImmunoTherapy of Cancer; 2017;5:1–13
4. Sanchez-Paulete AR, Mateus-Tique J, Mollaoglu G, et al. Targeting macrophages with CAR T cells delays solid tumor progression and enhances anti-tumor immunity. Cancer Immunol Res. 2022;CIR-21-1075. doi:10.1158/2326-6066.CIR-21-1075
5. Wroblewska A, Dhainaut M, Ben-Zvi B, Rose SA, Park ES, Amir E-AAD, et al Protein Barcodes Enable High-Dimensional Single-Cell CRISPR Screens. Cell. Elsevier Inc.; 2018;175:1141-1155.e16.
