近二十年，随着免疫检查点的不断挖掘，肿瘤免疫的研究突飞猛进，人们发现肿瘤细胞能表达PD-L1，与T细胞的PD-1结合，激活免疫抑制信号，从而逃逸肿瘤免疫。目前，靶向肿瘤细胞的PD-L1抑制剂，已经是行之成效的肿瘤治疗策略。
然而，当前PD-L1的靶向治疗存在个体反应差异大和耐药等缺点，导致现有的PD-L1抑制剂疗效差强人意[1]。因此，深入研究PD-L1的表达调控机制，对于增强PD-L1阻断疗效、抑制肿瘤细胞免疫逃逸至关重要。
有研究发现，肿瘤细胞PD-L1的表达与NF-κB的过度激活密切相关[2]。在经典的信号通路中，NF-κB蛋白被IκBα蛋白结合而受到抑制，在IκBα经磷酸化和泛素化被蛋白酶体降解后，NF-κB得以释放并转运入细胞核，诱导PD-L1等靶基因表达。
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肿瘤细胞在富含营养的微环境中生长，其增殖、侵袭和转移等恶性生物学行为受到营养物质调控。但是肿瘤微环境中的营养物质，特别是葡萄糖，是否会影响肿瘤细胞免疫逃逸，目前尚有待深入研究。
近日，浙江大学吕志民课题组发现，葡萄糖能诱导肿瘤细胞上调PD-L1表达。具体来说，糖酵解的关键酶HK2磷酸化IκBα，促进IκBα降解，从而激活NF-κB通路，进而促进PD-L1表达和肿瘤免疫逃逸。相关论文发表于顶级期刊Cell Metabolism上[3]。
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首先，研究人员使用葡萄糖处理胶质母细胞瘤等多种肿瘤细胞，发现无论是低氧还是常氧条件，PD-L1的表达都随葡萄糖浓度的提高而增加，而转录抑制剂能抵消葡萄糖的促PD-L1表达作用，这表明葡萄糖经糖酵解在转录水平对肿瘤细胞表达PD-L1进行了调节。
HK2位于线粒体外膜，是葡萄糖进行糖酵解的第一个限速酶，把葡萄糖磷酸化为6-磷酸葡萄糖（G6P）[4]。既往研究发现肿瘤组织糖酵解活跃，HK2过表达[5]。研究人员敲除了肿瘤细胞的HK2，发现即使给予葡萄糖或G6P刺激，PD-L1表达依旧减少，表明HK2是葡萄糖诱导PD-L1表达的关键。
研究人员对HK2介导PD-L1表达的机制进行了探究。
之前的研究表明，HK2的产物G6P能解救HK2从线粒体释放至细胞质[6]，免疫共沉淀实验发现HK2在细胞质中与IκBα结合，其结合被G6P促进，提示除糖酵解作用外，HK2还通过其他方式调控肿瘤细胞，而这种调控受到糖酵解影响。
既然HK2能磷酸化葡萄糖，那是否对IκBα也有激酶活性？
激酶实验发现HK2在T291位点磷酸化IκBα，葡萄糖和G6P能提高其磷酸化作用，表明糖酵解不仅促进HK2结合IκBα，还促进HK2磷酸化IκBα T291。
然而，与IκBα在T291位点磷酸化水平相反的是，肿瘤细胞经葡萄糖刺激后，IκBα表达竟然降低。这提示HK2介导的IκBα磷酸化负性调节了IκBα的表达，进一步的实验证实IκBα T291被HK2磷酸化后在蛋白层面促进了IκBα降解。
那么，IκBα蛋白在磷酸化后又是通过何种方式被降解的呢？
除经典的由IKK激酶介导的磷酸化后泛素-蛋白酶体降解途径外[7]，IκBα还能与蛋白酶μ-calpain结合并被降解[8]。研究人员对这两种方式分别进行了检测。
IKK磷酸化IκBα的位点在S32和S36，不在T291，而且T291突变不改变IκBα泛素化水平，提示HK2促进IκBα降解的机制不是泛素-蛋白酶体；蛋白结合实验发现IκBα T291磷酸化后与μ-calpain的结合增多，抑制μ-calpain能提高T291磷酸化的IκBα蛋白含量。这些结果表明，IκBα经HK2磷酸化后与μ-calpain结合被降解。
IκBα是NF-κB信号通路的抑制蛋白，IκBα的降解意味着NF-κB信号的激活。研究人员对肿瘤细胞的NF-κB和PD-L1进行了检测，发现过表达HK2，IκBα蛋白减少，NF-kB入核增多，PD-L1表达上调。糖酵解通过HK2磷酸化IκBα促进降解，激活NF-κB上调PD-L1表达。
HK2经G6P协助脱离线粒体后结合并磷酸化IκBα促进其降解，激活NF-κB上调PD-L1表达
接着，研究人员在体外检测了肿瘤细胞HK2/IκBα对T细胞的影响。他们将CD8+T细胞和肿瘤细胞共培养，发现在肿瘤细胞的HK2离开线粒体磷酸化IκBα后，CD8+T细胞γ干扰素产生减少，而在肿瘤细胞IκBα T291位点突变丧失磷酸化后，CD8+T细胞γ干扰素的生成抑制被解除。这说明HK2介导的IκBα T291磷酸化能抑制CD8+T细胞活化。
然后，研究人员在体内验证了HK2/IκBα在肿瘤发生和免疫逃逸中的作用。脑胶质瘤小鼠在HK2过表达后肿瘤更大，生存期更短，HK2和IκBα的结合增多，IκBα T291磷酸化上调，IκBα蛋白水平降低，PD-L1表达增加，CD8+T细胞浸润减少。
而在IκBα T291位点突变后，脑胶质瘤小鼠的肿瘤缩小，生存期延长，PD-L1水平降低，CD8+T细胞浸润和颗粒酶B表达增加。这些结果表明，HK2介导的IκBα T291磷酸化，减少了CD8+T细胞在肿瘤中的浸润和激活，以及随后的肿瘤免疫逃避。
最后，研究人员在脑胶质瘤中对靶向HK2的治疗进行了探索。他们发现HK2抑制剂和抗PD-1抗体联用，比单药更能抑制小鼠肿瘤生长，延长生存期，强烈抑制HK2介导的IκBα T291磷酸化和PD-1表达，显著提高CD8+T细胞在瘤体内的浸润和颗粒酶B表达，提示联合HK2抑制剂和免疫检查点阻断的疗法能消除肿瘤免疫逃避。
HK2过表达的脑胶质瘤小鼠肿瘤更大，生存期更短
此外，研究人员还通过自收样本并结合线上数据库，对HK2调控PD-L1表达的临床意义进行了验证。在脑胶质细胞瘤中，HK2 mRNA水平与IκBα T291磷酸化水平和PD-L1 mRNA表达呈正相关，与CD8+T细胞浸润和生存期呈负相关。
总的来说，这项研究以糖代谢为突破点，发现了糖酵解限速酶HK2能上调肿瘤细胞PD-L1表达，阐明了葡萄糖通过HK2/IκBα/NF-κB/PD-L1信号通路促进肿瘤免疫逃逸的机制，并在动物模型中证明了抑制HK2能增强CD8+T细胞在肿瘤组织内的浸润和活化，提高免疫治疗疗效，改善预后。
葡萄糖通过HK2/IκBα/NF-κB/PD-L1促进肿瘤免疫逃逸机制示意图
HK2不仅能作为糖代谢酶参与糖酵解，还能作为蛋白激酶参与肿瘤免疫逃逸。这为遏制肿瘤免疫逃逸，提高免疫检查点抑制剂疗效提供了新的靶点和思路。
参考文献
[1] Herbst RS, Soria JC, Kowanetz M, et al. Predictive correlates of response to the anti-PD-L1 antibody MPDL3280A in cancer patients. Nature. 2014;515(7528):563-567. doi:10.1038/nature14011
[2] Antonangeli F, Natalini A, Garassino MC, Sica A, Santoni A, Di Rosa F. Regulation of PD-L1 Expression by NF-κB in Cancer. Front Immunol. 2020;11:584626. doi:10.3389/fimmu.2020.584626
[3] Guo D, Tong Y, Jiang X, et al. Aerobic glycolysis promotes tumor immune evasion by hexokinase2-mediated phosphorylation of IκBα [published online ahead of print, 2022 Aug 19]. Cell Metab. 2022;S1550-4131(22)00345-X. doi:10.1016/j.cmet.2022.08.002
[4] Roberts DJ, Miyamoto S. Hexokinase II integrates energy metabolism and cellular protection: Akting on mitochondria and TORCing to autophagy. Cell Death Differ. 2015;22(2):248-257. doi:10.1038/cdd.2014.173
[5] Garcia SN, Guedes RC, Marques MM. Unlocking the Potential of HK2 in Cancer Metabolism and Therapeutics. Curr Med Chem. 2019;26(41):7285-7322. doi:10.2174/0929867326666181213092652
[6] Robey RB, Hay N. Mitochondrial hexokinases, novel mediators of the antiapoptotic effects of growth factors and Akt. Oncogene. 2006;25(34):4683-4696. doi:10.1038/sj.onc.1209595
[7] Ghosh S, Hayden MS. New regulators of NF-kappaB in inflammation. Nat Rev Immunol. 2008;8(11):837-848. doi:10.1038/nri2423
[8] Shumway SD, Maki M, Miyamoto S. The PEST domain of IkappaBalpha is necessary and sufficient for in vitro degradation by mu-calpain. J Biol Chem. 1999;274(43):30874-30881. doi:10.1074/jbc.274.43.30874
