CRISPR系统是细菌和古菌特有一种防御系统，自2012年开始被开发和改造为新一代的基因编辑工具，其中CRISPR-Cas9已成为革命性的基因组编辑平台，被广泛应用与生物技术和医学领域。其中来自化脓链球菌的Cas9（spCas9），由于其高效和识别松弛的5"-NGG-3"PAM序列，而得到了最广泛的应用。此外，基于spCas9的碱基编辑器（BE）还能实现对基因组DNA中单个碱基的替换。
然而，spCas9在实际临床应用中面临着一个大难题，spCas9蛋白长达1368个氨基酸，当其与sgRNA形成复合物时，已经超出了腺相关病毒（AAV）的装载能力范围（4.7k）。这大大限制了spCas9的体内基因编辑疗法的开发。
吉林大学李占军教授团队、赖良学教授团队合作在TheCRISPR Journal发表了题为：Compact Cje3Cas9 for Efficient In Vivo Genome Editing and Adenine Base Editing的研究论文。
(相关资料图)
该研究开发了一种名为Cje3Cas9的新型紧凑型Cas9，可用于体内的高效基因编辑和腺嘌呤碱基编辑。
目前，已经有一些策略可以一定程度上克服AAV对Cas9的递送难题，例如将spCas9和sgRNA分别用AAV包装并递送，以及将基于spCas9的碱基编辑器拆成两部分，用两个AAV分别递送再组装。
此外，还有研究致力于开发尺寸更小的Cas9同源物，以实现通过单个AAV的递送。例如saCas9（1053个氨基酸）、Nme1Cas9（1082个氨基酸）、Cje1Cas9（984个氨基酸）等等。
2021年6月，李占军、赖良学团队在Molecular Therapy期刊发表论文，在巴氏链球菌中发现并优化了名为SpaCas9的小型Cas9（1130个氨基酸）。SpaCas9可通过单个AAV递送并在体内进行有效的基因编辑。但和其他的基于Cas9的碱基编辑器（BE）一样，SpaCas9-BE无法包装到单个AAV载体中。
在众多小型Cas9中，来自空肠弯曲杆菌的Cje1Cas9仅984个氨基酸，因此特别适合使用AAV进行体内递送，更重要的是，基于Cje1Cas9的碱基编辑系统具有通过单个AAV递送的潜力。然而，Cje1Cas9需要识别非常复杂的N3VRYACPAM序列（V=A/C/G，R=A/G，Y=C/T），这极大地限制了其靶向基因组的范围。
因此，探索具有简单PAM序列要求的小型化CRISPR-Cas酶，以扩大对基因组的靶向范围非常重要。
在这项最新研究中，李占军、赖良学团队确定了两个CjeCas9的直系同源物，分别是Cje2Cas9和Cje3Cas9，它们的PAM序列不同于Cje1Cas9的N3VRYAC，而是更为简单的N4CYA。
研究团队接下来进行了体外和体内的基因编辑实验，实验结果显示，它们可以在人类细胞中诱导有效的基因组编辑，而且由于简单的PAM序列要求，显著扩大了基因组靶向范围。
此外，将Cje3Cas9与sgRNA微量注射到小鼠受精卵中后，可以有效地敲除小鼠的Tyr基因。它还能够通过单个AAV递送，有效敲除8周龄小鼠的肝脏中的Pcsk9基因，并有效降低小鼠的胆固醇水平。
更重要的是，研究团队进一步证实了，基于Cje3Cas9的碱基编辑器——8e-nCje3-ABE，能够与sgRNA一起包装到单个AAV中，并在成年小鼠肝脏中成功编辑Pcsk9基因，编辑效率高达12%。
总的来说，该研究开发了紧凑型的Cas9——Cje2Cas9和Cje3Cas9，他们具有更简单的PAM序列要求，而且能够包装到单个AAV中，扩展了CRISPR-Cas9工具的基因组八项范围，具有巨大的临床治疗价值。
值得一提的是，碱基编辑技术开创者刘如谦（David Liu）团队于2022年7月28日在Nature子刊NatureBiomedicalEngineering发表论文【3】，开发了一套紧凑型腺嘌呤碱基编辑器，能够使用单AAV载体递送并在肝脏、心脏、肌肉等组织中实现高效碱基编辑，编辑效率优于双AAV载体。详情：刘如谦将碱基编辑器装入单个AAV中，并成功进行体内高效编辑
对人PCSK9基因（人源化小鼠）、小鼠Pcsk9基因和Angptl3的体内编辑显示，能够降低目标蛋白水平90%以上，同时血浆胆固醇和甘油三酯也显著降低。
这项研究提高了碱基编辑的治疗潜力，确立了单AAV碱基编辑器系统的优势，并提供了一套具有广泛靶向能力的单AAV腺嘌呤碱基编辑器，以支持高效的体内碱基编辑。
