《科学》子刊：Aβ生理功能新发现！导致家族性阿尔茨海默病的瑞典型突变APP，竟能提高神经元突触密度！0今日视点

阿尔茨海默病是导致失智症的主要病因，其主要病理特点之一是β淀粉样蛋白（Aβ）形成的Aβ斑块[1-2]。

(资料图片仅供参考)

Aβ是淀粉样前体蛋白（APP）的一类水解产物，根据其肽链长度不同有不同的生理特性。在部分家族性阿尔茨海默病中，编码APP的基因发生了突变，导致其水解得到的Aβ产物也发生了变化[3]。突变产生的Aβ产物会在大脑中沉积，并对神经元产生毒性，因此Aβ至今都被研究者认为在疾病中扮演着重要的角色。

近年来，许多阿尔茨海默病药物的都致力于消除Aβ沉积和斑块，其中就包括了著名的aducanumab。但在此之前多数靶向Aβ的药物疗效都不尽人意，有些甚至加重了病人的认知衰退[4-6]。随着越来越多关于Aβ和阿尔茨海默病因果关系的讨论，科学家们正在重新认识和考量Aβ在正常生理条件和疾病条件下的作用。

近日，由斯坦福大学Thomas C. Südhof和Marius Wernig领衔的研究团队，在著名期刊SCIENCE TRANSLATIONAL MEDICINE上发表重要研究成果[7]。

他们发现与表达正常APP基因的神经元相比，携带瑞典型突变APP（能促进β-分泌酶对APP的裂解，从而增加Aβ的产生，进而导致家族性阿尔茨海默病）的神经元突触数量增加约20%，而且敲除APP基因则会减少突触数量和突触连接。

这一研究表明，Aβ蛋白与阿尔茨海默病的关系非常复杂。此外，研究人员还认为，这一研究成果也解释了在BACE抑制剂临床试验中观察到的认知障碍现象。

论文首页截图

为了研究单基因突变对神经元的影响，Südhof团队没有使用之前研究中使用的需要克隆传代和筛选的细胞系，而是通过腺相关病毒转染后，在正常的人类胚胎干细胞和诱导多能细胞中，产生了具有瑞典型突变的APP（K595N/M596L）[8]和正常的APP两种表型，并诱导其分化成兴奋性神经元。瑞典型突变发生在APP的16号外显子上，是导致家族型阿尔茨海默病的遗传因素之一。

经过改造的神经元（APPS^we/+）除了携带APP瑞典型突变以外，其余基因序列与野生型神经元（APP^+/+）一致。Südhof团队发现，APPS^we/+神经元与APP^+/+神经元相比，在表达相同水平的APP同时，伴随着Aβ40和Aβ42的含量的升高（P<0.05）。除此之外，APPS^we/+神经元还表现出磷酸化Tau蛋白水平的升高，但神经元的树突结构和胞体大小并没有很大的变化。

APPS^we/+神经元中Aβ40和Aβ42的含量升高

随后Südhof团队通过免疫组化和蛋白印记的实验分析发现，相比于APP^+/+神经元，APPS^we/+神经元的突触密度增加了约20%，突触相关的蛋白标志物的表达也提高了20%-80%。

这一发现让研究人员大吃一惊，因为Aβ在主流学说中一直被视为阿尔茨海默病的病理性“毒蛋白”，有大量的研究表明Aβ在人体内、老鼠模型和细胞模型中都产生了神经元毒性，会促进谷氨酸受体的胞吞作用以及阻碍记忆的形成[9-12]。

APPS^we/+神经元的突触密度和相关蛋白标志物的表达都有显著上升

因此为了进一步验证这一结果，Südhof团队继续进行了电生理实验。而电生理实验的结果表明，APPS^we/+神经元的自发微型兴奋性突触电流（mEPSC）的频率增加了约30%，mEPSC频率的变化是反应突触数量变化的指标之一。

之前的研究表明，APP的瑞典型突变会导致β分泌酶（BACE1）的剪切作用增强，进而导致Aβ产物增加。因此Südhof团队为了验证Aβ产物对突触的影响，在两种神经元的培养液中加入了BACE1抑制剂LY2886721。结果发现加入了抑制剂后，APP^+/+神经元的突触数量减少了约30%，APPS^we/+神经元中的突触增加也被遏止了（P<0.01）。

BACE1抑制剂会导致神经元的突触数量减少

与此同时，电生理学实验结果也表明，BACE1抑制剂的加入会导致mEPSC的频率在APP^+/+神经元中减少20%，在APPS^we/+神经元减少40%-60%。

如果Aβ产物增加会提升突触的数量，那么APP的缺失就应该有相反的效果。因此Südhof团队对在胚胎干细胞中进行了APP基因的敲除。结果发现敲除了APP基因的神经元突触密度减少了20%-35%，相应的mEPSC频率也减少了20%-30%。由此得出，APP基因的缺失会抑制突触数量的增长和突触功能，而APP的瑞典型突变却有相反的效果。

APP缺失的神经元突触密度降低

需要注意的是，由BACE1剪切下来的APP产物并不是唯一的，而这些产物也能够继续分解得到Aβ。通过比较，Südhof团队发现，在APP瑞典型突变的情况下增多，而在APP缺失的情况下减少的产物有三种，它们分别是sAPPβ，C99和Aβ。其中，C99能够水解得到Aβ，而sAPPβ则不能继续水解生成Aβ。

因此为了探究具体是哪一种产物会影响神经元突触的变化，研究人员利用HEK293T细胞表达了APP，sAPPβ和C99，并将它们分别加入APP缺失的神经元和APP^+/+神经元中，观察它们对这两种神经元的形态和电生理特性的影响。

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结果表明外源性APP和C99的加入，使APP^+/+神经元的突触密度增加了25%，也使APP缺失的神经元突触密度增加了25%。电生理学结果也表明两种神经元中的mEPSC频率，在加入了外源性APP和C99后都增加了30%。而加入外源性的sAPPβ的神经元与APP缺失的神经元相比，突触密度并没有显著性增加。

因为在这三种外源性物质中，只有sAPPβ不能产生Aβ，表达外源性APP和C99的细胞的上清液中，都检测到了Aβ浓度的升高。因此这些结果也表明，Aβ可能是影响神经元突触密度和突触连接的关键物质。

外源性APP和C99的加入可以增加神经元突触密度和mEPSC频率

这项研究的实验结果表明，虽然在长久以来Aβ和APP都被视为造成阿尔茨海默病细胞毒性的关键物质和基因[9,13]，但在生理环境下，APP至少能够通过产生Aβ来促进人类神经元突触的形成。

需要指出的是，此前大部分基于Aβ的动物模型都引入了异常高浓度的Aβ，并且因为使用的转基因技术的差异，导致各个模型的基因背景存在差异[14-15]，不能够很好地模拟真实疾病状态下的Aβ产物。

对于这一研究结果，有科学家指出不应该曲解为不能清除AD患者大脑中的Aβ聚集物，毕竟一些临床研究已经证实清除Aβ聚集物对AD患者是有益的[16]。

参考文献：

[1] Long JM, Holtzman DM. Alzheimer Disease: An Update on Pathobiology and Treatment Strategies.Cell. 2019;179(2):312-339. doi:10.1016/j.cell.2019.09.001

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[16]https://www.alzforum.org/news/research-news/cultured-human-neurons-av-spurs-synapse-growth