K-Ras是癌症中突变频率最高的癌基因之一，大约30%的癌症中都存在K-Ras突变，介导了多个致癌信号通路的激活[1]。一直以来，针对K-Ras突变的靶向药物研发进展缓慢，直到近期，K-RasG12C的抑制剂被成功开发，打破了K-Ras“不可成药”的僵局，并在肺癌中展示出卓越的临床疗效[2]。
然而，K-RasG12C抑制剂存在严重的原发性耐药现象，且其治疗还可通过基因组改变驱动K-RasG12C抑制剂的继发性耐药[3]。因此，开发新的K-RasG12C抑制剂对克服癌症患者的耐药性至关重要。
为了解决K-RasG12C抑制剂的耐药性，科学家想过很多办法。抗体药物联合靶向药物可极大地改善靶向治疗的耐药，但抗体药物对于细胞内蛋白的识别却困难重重，面对位于肿瘤细胞里面的K-Ras，也是心有余而力不足。
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不过，已有研究在癌症患者样本中观察到，K-Ras突变肽可被MHC-I加工呈递[4]，也就是被“翻”到细胞表面。这岂不是方便抗体药物来施展拳脚？如果这种新抗原可以作为肿瘤特异性新表位，或许有助于解决K-RasG12C抑制剂耐药这一棘手问题 [5]。但还没有相关研究进行深入探讨。
近日，加利福尼亚大学Charles S. Craik带领的研究团队于Cancer Cell发表了一项重要研究成果，为克服K-RasG12C抑制剂的耐药问题提供了一个新策略。
这项研究发现，K-RasG12C抑制剂ARS1620共价修饰后的K-RasG12C可被加工呈递到肿瘤细胞表面（包括耐药细胞），成为肿瘤特异性新表位。通过靶向这一新抗原所开发的双特异性抗体，可介导免疫细胞有效杀伤K-RasG12C抑制剂耐药的肿瘤细胞[6]。
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ARS162是K-RasG12C抑制剂的一种，可以永久把自己整个“挂”在K-Ras上，即通过与K-Ras蛋白上的的半胱氨酸发生共价结合来不可逆地修饰K-Ras，这样一来便生成了K-Ras突变肽。此次，Charles S. Craik团队便要看看，ARS162是否可以一手直接抑制K-Ras，再留一后手把K-Ras翻到细胞表面，作为肿瘤特异性新表位。
研究人员通过ELISA法检测了ARS1620修饰后的K-Ras突变肽，能否与最常见的两个MHC-I类等位基因（HLA-A * 02:01和HLA-A * 03:01）形成MHC-I类复合物。结果表明，修饰产生的两种K-Ras肽均可与这两个等位基因相结合。这说明，肿瘤细胞经过ARS1620的 “蹂躏”后，细胞内的K-Ras被修饰，并可由MHC-I加工呈递到细胞表面，成为新抗原（图1）。
图1. 修饰后的K-Ras肽可被加工呈递到细胞表面
随后，研究人员通过噬菌体文库发现了能够与这个新抗原发生特异性结合的抗体片段，并在186个噬菌体克隆中最后筛选出5个高亲和力的抗体。经比较5个抗体的特异性，发现抗体P1A4具有较短的重链互补决定区，以及能够与ARS1620分子发生高度特异性的相互作用。因此，研究人员将P1A4鉴定为特异性识别修饰后K-Ras肽的抗体（图2）。
图2. P1A4是特异性识别修饰后K-Ras肽的重组抗体
那这种特异性抗体是否可以有效杀伤K-RasG12C抑制剂耐药的细胞呢？
首先，研究人员在三种K-RasG12C细胞系（H358、Miapaca-2、SW1573）中进行验证，发现携带K-RasG12C的细胞经治疗后，确实可以将ARS1620修饰后的K-Ras肽通过MHC-I呈递出来。另外还证明，新抗原的加工提呈过程，如蛋白水解降解、内质网转运、与MHC-I的结合等，都依赖于ARS1620分子的修饰。
图3. ARS1620与MHC-I类复合物的共定位
接下来，研究人员进一步验证了特异性抗体P1A4对K-RasG12C抑制剂耐药细胞的治疗效果。
基于对ARS1620耐药的细胞系和外周血单核细胞（PBMC）的共培养模型，研究人员发现，P1A4干预后，PBMC可有效杀伤这些耐药细胞（69%±9%）（图4E）。
除了原发耐药，K-RasG12C抑制剂还存在获得性耐药的现象。因此，研究人员进一步探究了P1A4是否可对K-RasG12C抑制剂获得性耐药的细胞同样有效。
为验证这一结论，研究人员构建了K-RasG12C抑制剂获得性耐药的细胞系（H358-G12V），并共培养PBMC，发现P1A4干预后，PBMC同样可有效杀伤获得性耐药的细胞（77%±4%）（图4F）。
图4. P1A4可介导免疫细胞杀伤ARS1620耐药细胞
此外，研究人员基于上述获得性耐药细胞系，构建了K-RasG12C异种移植小鼠模型。结果显示，在ARS1620治疗后的肿瘤组织可观察到，抗体P1A4能够与识别出这些耐药细胞并与之发生特异性结合。因此，ARS1620联合P1A4或许会成为解决K-RasG12C抑制剂耐药的治疗策略之一。
如此来看，即使躲开了ARS1620的“正面攻击”，其细胞内的K-Ras也会被其“附身”，即不可逆地修饰，并提呈到细胞表面成为新抗原。而在抗体P1A4的清剿下，这些对ARS1620耐药的肿瘤细胞再次暴露，终究难逃一死。
图5. ARS1620附身K-Ras上后，导致细胞将新的K-Ras扔出细胞，被特异性抗体识别
综上所述，这项研究揭示了K-RasG12C抑制剂ARS1620共价修饰后的K-Ras肽具有抗原呈递特性，并靶向这种修饰后的肽开发出双特异性抗体，且这种特异性抗体可介导免疫细胞有效杀伤K-RasG12C抑制剂耐药的肿瘤细胞，为克服K-RasG12C抑制剂耐药提高其临床疗效提供了一种新策略。
参考文献：
1. Huang L, Guo Z, Wang F, et al. K-Ras mutation: from undruggable to druggable in cancer. Signal Transduct Target Ther. 2021 Nov 15;6(1):386. doi: 10.1038/s41392-021-00780-4.
2. Skoulidis F, Li BT, Dy GK, et al. Sotorasib for Lung Cancers with K-Ras p.G12C Mutation. N Engl J Med. 2021 Jun 24;384(25):2371-2381. doi: 10.1056/NEJMoa2103695.
3. Awad MM, Liu S, Rybkin II, et al. Acquired Resistance to K-RasG12C Inhibition in Cancer. N Engl J Med. 2021 Jun 24;384(25):2382-2393. doi: 10.1056/NEJMoa2105281.
[4] Tran E, Robbins PF, Lu YC, et al. T-Cell Transfer Therapy Targeting Mutant K-Ras in Cancer. N Engl J Med. 2016 Dec 8;375(23):2255-2262. doi: 10.1056/NEJMoa1609279.
[5] Canon J, Rex K, Saiki AY, et al. The clinical K-Ras(G12C) inhibitor AMG 510 drives anti-tumour immunity. Nature. 2019 Nov;575(7781):217-223. doi: 10.1038/s41586-019-1694-1.
[6] Zhang Z, Rohweder PJ, Ongpipattanakul C, et al. A covalent inhibitor of K-Ras(G12C) induces MHC class I presentation of haptenated peptide neoepitopes targetable by immunotherapy. Cancer Cell. 2022 Sep 12;40(9):1060-1069.e7. doi: 10.1016/j.ccell.2022.07.005.
