全球每年约有220万人罹患肺癌，180万人死于肺癌[1]，肺癌严重威胁人类生命健康。EGFR突变是最常见的肺癌突变类型，尤其在包括中国在内的亚洲地区。
自2002年问世以来，针对EGFR突变的酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKI），大大延长了肺癌患者的生存时间，已成为EGFR突变肺癌一线治疗的最佳选择。
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可是，道高一尺，魔高一丈。EGFR-TKI应用一段时间后，患者不可避免地出现耐药，成为制约肺癌靶向治疗的一个难点[2]。为克服耐药，EGFR-TKI不断更新换代，“打补丁”式地进行完善，从以吉非替尼为代表的一代，到以奥希替尼为代表的三代，再到临床试验中的四代，一代更比一代强，然而，耐药依旧层出不穷。
治疗过程中产生新突变，是肺癌获得性耐药的一个重要原因[3]。如对一代和二代TKI耐药的T790M突变，对三代TKI耐药的C797S突变。但是，其详细机制尚有待阐明。
近日，由以色列魏茨曼科学研究所Yosef Yarden领衔的研究团队，揭示了肺癌经EGFR-TKI治疗产生耐药突变的机制，相关论文发表于肿瘤学顶级期刊Cancer Discovery上[4]。
他们发现，肺癌细胞经EGFR-TKI刺激后，AXL被激活。AXL一方面激活RAD18，启动DNA易错旁路修复机制，加速耐药突变的出现；另一方面激活MYC，调控嘌呤合成，使核苷酸库失衡，增强诱变。如果在EGFR-TKI的治疗中联用抗AXL抗体，能抑制耐药性的产生，防止肺癌复发。
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研究伊始，研究人员使用EGFR-TKI处理肺癌细胞，获得不同程度的耐药亚克隆细胞，对这些细胞进行转录组测序，发现GAS6是持久耐药细胞中最明显的高表达基因。与此同时，来自临床的样本也发现，EGFR-TKI治疗失败的肺癌患者也高表达GAS6。
既往研究发现，GAS6及其受体AXL在癌症中参与了肿瘤细胞的增殖和转移[5]。研究人员对AXL在肺癌中的表达进行检测，发现TKI治疗后复发的肺癌小鼠AXL表达升高，AXL磷酸化水平也上调。这提示GAS6-AXL轴可能还参与肺癌的TKI耐药。
为了检验假说，研究人员分别过表达和敲除肺癌细胞的AXL，然后把细胞暴露于EGFR-TKI。相比于野生型的肺癌细胞，AXL过表达细胞存活率增加，而AXL敲除细胞存活率降低。
接着，研究人员又在体内对AXL的促耐药作用进行了验证，把AXL过表达肺癌细胞和AXL敲除细胞分别接种于裸鼠，然后用TKI治疗荷瘤小鼠。AXL过表达的肺癌小鼠更早地出现耐药，AXL敲除的肺癌小鼠则完全没有复发现象。
这些结果表明，GAS6-AXL轴被TKI治疗激活后，促进了肺癌细胞耐药。
AXL过表达的肺癌小鼠生长加快，AXL敲除的肺癌小鼠肿瘤生长减慢
我们都知道，DNA损伤是对细胞的致命打击，为应对DNA损伤，细胞会启动DNA修复机制。TLS聚合酶参与DNA损伤修复，直接在损伤的DNA上掺入核苷酸，延续DNA复制。而TKI的作用机制之一即是破坏细胞对DNA损伤的修复能力[6]。
于是，研究人员检测了TKI治疗后肺癌细胞的DNA损伤和修复情况。
经TKI处理后，肺癌细胞DNA双链断裂，产生ROS，凋亡增加，存活下降，RAD18和TLS聚合酶等DNA修复相关酶表达上调。而在AXL过表达后，肺癌细胞能抵抗TKI的打击，DNA断裂减少，ROS水平降低，凋亡被抑制，存活率升高，RAD18和TLS聚合酶的表达上调至更高水平。
RAD18是一种E3泛素连接酶，通过诱导PCNA单泛素化和招募TLS聚合酶来激活DNA的易错旁路修复[7]。易错旁路途径虽然能提高细胞对DNA损伤的耐受性，但却牺牲了复制的保真度，它在损伤的DNA模板对侧掺入错误的核苷酸，引发基因组突变。
研究人员对AXL和RAD18的关系进行了探究，发现AXL能与RAD18结合，增强RAD18的类泛素化，减少RAD18的泛素化，因而增强RAD18对PCNA的单泛素化修饰，进而启动易错旁路途径。
接着，研究人员检测了TKI治疗后肺癌的基因组变化情况，发现TKI诱导了DNA的碱基改变，耐药突变T790M开始出现。AXL的表达水平和肺癌的突变负担呈正相关，过表达AXL能增加T790M突变频率，使用抗AXL抗体处理肺癌细胞，可显著降低T790M突变的丰度。
这些结果表明，AXL促进了TKI对肺癌诱导的RAD18和TLS聚合酶表达上调，激活了易错旁路途径，加速了耐药突变的产生。
AXL能提高T790M耐药突变频率，抗AXL抗体可显著降低T790M突变
对AXL调控的通路进行分析，研究人员发现AXL能影响肺癌细胞的核苷酸代谢，主要是嘌呤、组氨酸和谷氨酰胺途径。由于DNA的复制取决于脱氧核苷酸池[8]，研究人员推测，AXL可能还通过核苷酸代谢，进一步增强诱变作用。
研究人员分别过表达和敲除AXL，发现肺癌细胞嘌呤代谢相关基因的表达，以及嘌呤合成途径中的代谢物也相应地发生变化。同位素标记实验显示，AXL加速了嘌呤的合成。
MYC是AXL的转录靶点，在肺癌中，MYC的表达和AXL呈正相关，而MYC能调控嘌呤合成酶。因此，研究人员得出结论，AXL通过激活MYC促进嘌呤合成，进而增强肺癌的获得性突变。
最后，研究人员开发出了一种抗AXL抗体，分别在体内外检测抑制AXL对TKI疗效的增强作用。
在EGFR-TKI的治疗中联用抗AXL抗体，肺癌细胞的AXL、RAD18和TLS聚合酶表达下调，凋亡增加，耐药细胞减少。动物实验表明，相比于单药治疗后出现复发，肺癌小鼠在联合用药后完全无复发。抗AXL抗体能抑制肺癌的TKI耐药，消除复发。
EGFR-TKI治疗联用抗AXL抗体能抑制肺癌生长，防止复发
总的来说，研究人员发现暴露于EGFR-TKI后，肺癌细胞激活了GAS6-AXL途径，AXL同时通过非转录和转录这两种方式促进耐药突变的产生。非转录方式通过增强类泛素化和减少泛素化激活RAD18，RAD18招募TLS聚合酶启动易错旁路途径。转录方式通过激活MYC促进嘌呤合成，进而使肺癌细胞的核苷酸库失衡。
这项研究不仅揭示了肺癌在EGFR-TKI治疗后出现耐药的机制，也用实验证明靶向AXL是消除EGFR突变型肺癌耐药的一个潜在策略。
参考文献
[1] Sung H, Ferlay J, Siegel RL, et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN Estimates of Incidence and Mortality Worldwide for 36 Cancers in 185 Countries. CA Cancer J Clin. 2021;71(3):209-249.
[2] Nagano T, Tachihara M, Nishimura Y. Mechanism of Resistance to Epidermal Growth Factor Receptor-Tyrosine Kinase Inhibitors and a Potential Treatment Strategy. Cells. 2018;7(11):212. Published 2018 Nov 15. doi:10.3390/cells7110212
[3] Garraway LA, Jänne PA. Circumventing cancer drug resistance in the era of personalized medicine. Cancer Discov. 2012;2(3):214-226. doi:10.1158/2159-8290.CD-12-0012
[4] Noronha A, Belugali Nataraj N, Sang Lee J, et al. AXL and error-prone DNA replication confer drug resistance and offer strategies to treat EGFR-mutant lung cancer [published online ahead of print, 2022 Jul 27]. Cancer Discov. 2022;CD-22-0111. doi:10.1158/2159-8290.CD-22-0111
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[7] Stelter P, Ulrich HD. Control of spontaneous and damage-induced mutagenesis by SUMO and ubiquitin conjugation. Nature. 2003;425(6954):188-191. doi:10.1038/nature01965
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