目前手术仍然是局限性结直肠癌（CRC）患者的主要治疗方法，手术切除后，为防止复发，Ⅲ期或高危Ⅱ期结直肠癌患者通常接受辅助化疗。其中，辅助化疗可以降低III期CRC患者的癌症复发风险，而对II期CRC患者的疗效仍有争议。因此，尽早对患者进行分层，有助于制定合适的治疗方案和监测。
随着技术的快速发展，越来越多的证据表明，患者血液样本中检测到的循环肿瘤DNA（ctDNA）是从肿瘤发生到复发的有效指标。基于ctDNA的液体活检能够检测肿瘤分子残留病灶（MRD），评估辅助化疗的有效性，并提示复发病变。
大多数研究都聚焦于利用下一代测序技术对ctDNA变异进行分析，但这种检测方法因流程复杂、检测周转时间长、费用昂贵而难以实施。与此同时，也有人提出以ctDNA甲基化为血液生物标志物，用于监测肿瘤复发。
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复旦大学附属肿瘤医院的蔡国响团队和上海交通大学医学院附属仁济医院的王争团队，基于299例CRC患者的队列研究结果发现，使用6种ctDNA甲基化标志物来评估ctDNA状态，在风险分层和辅助化疗指导、复发监测中具有巨大潜力[1]。
文章于近日发表在JAMA Oncology期刊上。
这项研究是全球首个应用基于PCR的血液ctDNA多基因甲基化技术于结直肠癌复发预测和复发监测的多中心研究。
图：论文首页截图
在2021年发表于Gastroenterology期刊的文章中，蔡国响等人已经系统地展示了多基因甲基化检测方法从标志物筛选、优化到验证的完整过程[2]。
他们选择出6种在组织和血浆中具有检测能力的标志物，用于多位点血液检测。初步验证结果表明，这种多基因甲基化检测方式具备结直肠癌早期筛查和术后监测复合功能。目前还需要提供更加充分的证据来支持，以加速将其加入到患者监测的标准护理中。
此次研究共纳入2019年12月12日-2022年2月28日期间，影像学检查结果为无任何分子残留病灶的299名I-III期CRC患者，均为亚洲人，女性占37.8%。
这些患者在手术前后、辅助化疗期间以及2年随访期间每隔3个月的时间点，接受血液样本采集。研究者们共得到1228份血液样本，并使用检测血液中ctDNA甲基化的状态。ctDNA阳性定义为至少存在1个阳性标志物，否则定义为ctDNA阴性。
结果显示，在术前，78.4%的患者呈ctDNA阳性。按分期来看，I、II、III期CRC患者的ctDNA阳性检出率分别为65.1%、82.7%、81.5%。
术后大约1个月时，23.1% 的患者为ctDNA阳性，且ctDNA阳性患者的复发风险显著高于ctDNA阴性患者（HR 17.5；95%CI 8.9-34.4；P<0.001）。使用这6种ctDNA甲基化标志物检测复发的敏感性为78.0％，特异性为90.2％，在不同分期中一致。
对使用单独标志物的效果进行考察时发现，单个标志物检测复发的敏感性为26%-52%，对应的特异性为95%-98%，这6种标志物对检测效果的贡献依次为67％、59％、59％、56％、49％和33％。这些表明，比起单个标志物单打独斗，这6种标志物的组合使用能更全面地捕捉到术后复发风险。
A：术后1个月的无复发风险；B：6种ctDNA甲基化标志物
另外，多基因甲基化检测也可以作为癌胚抗原（CEA）血液检测的辅助手段来预测术后复发风险。
术后大约1个月时，在两项检测中任何一项检测结果为阳性的患者，较两项检测结果均为阴性的患者来说，手术后复发风险更高（HR 19.0；95%CI 8.9-40.7；P<0.001）。这两种血液检测方法联合使用时，检测术后复发的敏感性为83.3%，特异性为86.5%。
随后，研究者们探讨ctDNA甲基化是否可以指导术后辅助治疗的选择。
他们发现，术后1个月时ctDNA呈阳性的高危III期CRC患者，6个月的辅助化疗可降低复发风险。不过，对于术后1个月时ctDNA呈阳性的低危III期CRC患者来说，接受3个月或6个月的辅助化疗结果无明显差别。这表明，术后1个月时的ctDNA状态能够用来指导和监测辅助化疗，并具有预后的作用。
不仅如此，分析结果显示，无论患者在术后1个月时的ctDNA为阴性还是阳性，在接受辅助化疗后ctDNA呈阳性的患者，无复发生存期明显短于在接受辅助化疗后呈ctDNA阴性患者（HR 13.8；95%CI 5.9-32.1；P<0.001）。
最后，研究者们对ctDNA状态进行了纵向分析。
他们先是发现，临床综合治疗结束后的第一时间，ctDNA呈阳性的患者的无复发生存期更短（HR 20.6；95%CI 9.5-44.9；P< 0.001）。进一步分析表明，如果患者在接受临床综合治疗前后的ctDNA状况持续不变，这种关联更加突出，即自始至终为ctDNA阳性的患者，其无复发生存期明显短于持续ctDNA阴性的患者（HR 68.8；95%CI 18.4-257.7；P<0.001）。
除此之外，基于对肿瘤复发患者的数据分析发现，临床综合治疗后，其ctDNA甲基化检测的阳性结果比影像学检查更早地提示肿瘤复发，中位领先时间为3.3个月。
D：治疗前后始终为ctDNA阳性的患者，无复发生存期明显更短；B：ctDNA状态能够更早提示复发
根据这项研究和已有的研究成果，研究者们提出了一些ctDNA甲基化检测的潜在临床应用：1）在术后1个月，如果ctDNA检测结果为阳性，无论肿瘤分期，建议进行辅助化疗；如果为阴性，降低标准辅助化疗的剂量；2）如果标准辅助化疗后ctDNA检测结果依旧阳性，应延长辅助化疗时间；3）如果患者在结束综合治疗后，随访期间的ctDNA检测结果为阳性，应考虑更频繁的影像学检查，以便早诊断出肿瘤复发。
总而言之，这项研究证明，通过检测6个ctDNA甲基化位点来评估ctDNA状态，这个易于实施的技术可重复且可靠，有助于进行风险分层、分子残留病变评估和复发检测。这项血液ctDNA多基因甲基化检测技术，能够帮助CRC患者在选择术后辅助化疗、评估治疗持续时间和强度、随访护理时做出决策，接受个性化治疗，减少过度治疗的风险。
参考文献：
[1]https://jamanetwork.com/journals/jamaoncology/article-abstract/2803768
[2]Cai, G., Cai, M., Feng, Z., Liu, R., Liang, L., Zhou, P., ColonAiQ Group, Zhu, B., Mo, S., Wang, H., Lan, X., Cai, S., Xu, Y., Wang, R., Dai, W., Han, L., Xiang, W., Wang, B., Guo, W., Zhang, L., … Su, Z. (2021). A Multilocus Blood-Based Assay Targeting Circulating Tumor DNA Methylation Enables Early Detection and Early Relapse Prediction of Colorectal Cancer. Gastroenterology, 161(6), 2053–2056.e2. https://doi.org/10.1053/j.gastro.2021.08.054
