CRISPR-Cas系统因其简便性及高效性，已被广泛用于基础生命科学研究、遗传疾病治疗及作物性状改良等领域。作为抵御细菌病毒和外源遗传物质侵入的适应性免疫系统，细菌及部分巨噬菌体在亿万年的适应性进化中发展出许多不同的CRISPR-Cas系统，目前已发现超过30种不同的亚型。
II型CRISPR-Cas9和V-A型CRISPR-Cas12a是目前使用率最高的两种CRISPR-Cas系统。但是，Cas9和Cas12a蛋白较大（>1200氨基酸），大小超过AAV递送系统的包装极限，极大地限制了其在体基因治疗中的应用。
近年来，V-F亚型CRISPR-Cas12f系统因其极小的体型（约400-700个氨基酸大小）和高特异性而备受关注。然而，现在报导的Cas12f系统在真核细胞中的编辑活性还相对较低，并且其较高的PAM识别特异性导致可靶向范围窄，从而限制了它们的进一步应用。因此，亟待开发新的高活性且可靶向范围更广的CRISPR-Cas12f系统。
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辉大基因创新研究院研发团队在Nature Communications期刊发表了题为：Engineered CRISPR-OsCas12f1 and RhCas12f1 with robust activities and expanded target range for genome editing的研究论文。
该研究综合利用生信大数据挖掘、高通量筛选、蛋白质和sgRNA定向改造、PEM-seq脱靶分析技术及体内外基因治疗有效性分析等技术手段，开发了两种在哺乳动物细胞中具有高活性、靶向范围广且高保真的新型CRISPR-Cas12f系统：enOsCas12f1（433个氨基酸大小，识别5"-TTN PAM）和enRhCas12f1（415个氨基酸大小，识别5"-CCD PAM）。
基于enOsCas12f1，研发团队进一步开发了可诱导激活的DD-enOsCas12f1、表观编辑器（miniCRISPRoff）和基因表达激活器（denOsCas12f1-VPR）。该研究不仅丰富了基因编辑工具箱，更重要的是对于基因编辑领域进一步迈入“迷你时代”有着特别的意义。
研究团队首先通过高通量哺乳动物细胞功能鉴定平台对34种之前未被报导的CRISPR-Cas12f1系统进行了编辑活性鉴定，从中筛选得到6个具有哺乳动物细胞活性的新型CRISPR-Cas12f1系统。其中，OsCas12f1和RhCas12f1编辑活性最好，且它们都有非常迷你的体型，分别只有433个氨基酸和415个氨基酸。为进一步提高OsCas12f1和RhCas12f1的活性，研究人员对OsCas12f1、RhCas12f1的蛋白和sgRNA分别进行了定向改造，开发得到高活性版本enOsCas12f1和enRhCas12f1。通过头对头比较，发现enOsCas12f1效率远高于已报导活性最好的Cas12f（Un1Cas12f1_ge4.1），部分靶点能实现90%以上的切割效率，并且靶向范围更广。
图1. 新型CRISPR-Cas12f的筛选、鉴定及优化
为了解决Cas12f在体内长期表达的潜在风险，研究团队通过将可降解结构域与enOsCas12f1融合，开发得到化学小分子TMP诱导型DD-enOsCas12f1。在人源化DMD模型小鼠体内，通过单个AAV递送方式发现enOsCas12f1和DD-enOsCas12f1介导的exon51删除能有效恢复dystrophin蛋白的表达。DD-enOsCas12f1的活性在体内受到TMP的调控。
值得一提的是，TMP作为FDA认证安全的化学小分子，为DD-enOsCas12f1进一步应用于疾病治疗提供了良好基础。此外，基于enOsCas12f1切割活性缺失突变体——denOsCas12f1，研究人员进一步开发得到表观编辑器（miniCRISPRoff）和基因表达激活器（denOsCas12f1-VPR），并在哺乳动物细胞中验证了其活性，实现了不产生DSB的高效基因表达调控。
图2. enOsCas12f1和DD-enCas12f1的体内效率验证以及enOsCas12f1的衍生工具开发
辉大基因创新研究院孔祥锋博士、张海南博士、李国玲博士、汪子康博士和孔旭强为本研究论文的共同第一作者，王乐聪等积极参与课题并做出重要贡献。辉大基因创始人＆首席科学顾问杨辉研究员、辉大基因创新研究院院长周英思博士为该论文通讯作者。
