人体中有一类胞嘧啶脱氨酶家族名叫APOBEC3（载脂蛋白B mRNA编辑酶催化亚基3）。目前这个家族中有七个成员。它们在抗病毒的天然免疫中起重要作用，如在人体感染HIV-1等逆转录病毒时可以使病毒单链DNA的碱基脱氨基产生突变，从而抑制逆转录病毒复制[1]。
然而，这类酶也可以在宿主的基因组中发挥脱氨基作用，使TCW（W= A或T）基序中的C转换T或者G，即发生APOBEC3诱导的突变。随着测序技术的发展，科学家们发现APOBEC3引发的突变在人类癌症中广泛存在，并且多与癌症的恶性进展有关[2]。
但迄今为止APOBEC3诱发的突变与癌症相关性的研究证据多基于对测序结果的分析，缺少直接的因果实验来说明APOBEC3家族成员们在癌症中的具体作用。因此，更直接的实验证据对了解单个APOBEC3蛋白在体内如何诱发突变并促进癌症恶化十分重要，并有可能成为癌症治疗的潜在靶点。
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近日，来自美国威尔康奈尔医学院的Bishoy M. Faltas教授团队在癌症领域的著名期刊Cancer Research发表最新研究[3]，他们利用转基因小鼠模型，开创性地发现人APOBEC3G可显著增加肿瘤细胞突变的数量，促进了膀胱肿瘤的异质性并加速了小鼠死亡。
文章题图
与人类相比，小鼠只有一个Apobec3（mA3）基因。因此，敲除小鼠Apobec3后可为研究人的单个APOBEC3蛋白功能提供了一个很好的模型。在本研究中，Faltas团队在敲除了Apobec3基因的小鼠体内转入人APOBEC3G（hA3G）基因，从而构建出能稳定表达人APOBEC3G的转基因小鼠模型（hA3G+mA3-/-）。
hA3G+mA3-/-小鼠的膀胱、肺和脾脏组织中均有APOBEC3G基因表达，SDS-PAGE蛋白质印迹实验也证实了APOBEC3G蛋白在膀胱组织中的表达。
hA3G+mA3-/-小鼠及其对照mA3-/-小鼠模型的构建
考虑到单独的APOBEC3诱导突变并不足以引发肿瘤，Faltas团队使用化学致癌物BBN诱发肿瘤。在同样接受BBN处理后，与同窝对照mA3-/-小鼠（膀胱癌发生率52.6%）相比，hA3G+mA3-/-小鼠表现出更高的膀胱癌发生率（76%）和显著降低的存活率（P=0.007）。
BBN处理hA3G+mA3-/-小鼠及其对照mA3-/-小鼠膀胱癌的发生率（左）和生存期（右）
Faltas团队通过全基因组测序进一步研究了APOBEC3G对肿瘤细胞突变的影响，他们发现与mA3-/-小鼠来源的肿瘤相比，hA3G+mA3-/-小鼠来源的肿瘤具有显著增高的突变负荷（P=0.04），基因组中包含了更多的APOBEC相关突变，并存在更长的基因片段缺失。
同时，western blotting、荧光标记等多种方法也证实了APOBEC3G的核定位。由于核定位是诱导突变的先决条件，因此APOEBC3G的核定位也从另一个侧面为其诱导突变的作用提供了证据。
为了验证APOBEC3G诱导的突变和基因组拷贝数改变是导致肿瘤异质性的关键因素，Faltas团队首先使用两种不同的计算方法EXPANDS和Pyclone-vi分别量化了每个肿瘤中克隆的数量和大小。发现与mA3-/-小鼠来源的肿瘤相比，hA3G+mA3-/-小鼠来源肿瘤中的克隆数量显著增加（P=0.001）。
随后，他们通过计算香农熵表征系统发育多样性，熵值越高代表多样性越高。与mA3-/-小鼠来源的肿瘤相比，hA3G+mA3-/-小鼠来源肿瘤的熵值显著升高（P=0.001），表明其具有更高的多样性。
Faltas团队基于希尔数对不同来源肿瘤的多样性分布进行比较，并通过一系列分析和计算，最终确认与mA3-/-小鼠来源的肿瘤相比，hA3G+mA3-/-小鼠来源的肿瘤具有显著增加的克隆多样性。也就是说，APOBEC3G确实是导致肿瘤克隆异质性的原因。
不同肿瘤中的克隆多样性气泡图（每个圆圈=1个单独亚群，不同颜色表示亚群的大小）
接下来，Faltas团队还对APOBEC3G诱导的突变特征进行了分析。结果表明， hA3G+mA3-/-小鼠来源肿瘤的三核苷酸突变谱与其对照mA3-/-小鼠具有显著差异（P=0.03）。具体表现为hA3G+mA3-/-小鼠来源肿瘤在CC基序中具有明显增加的C>T突变。
在与其同家族成员如APOBEC3A诱导的突变（通常为TCW基序中的C转换T或者G）进行比较后发现，APOBEC3G诱导的突变具有不同的突变特征，即在CCC、CCT和TCC基序中具有更高的C>T替换频率。
最后，为了进一步弄清APOBEC3G在人类癌症中的作用，Faltas团队分析了来自TCGA癌症数据库中，包括21种癌症类型的8292个患者肿瘤样本中APOBEC3G的mRNA表达量数据和突变特征。
他们发现APOBEC3G mRNA在所有癌症类型中都普遍表达，通过标准化计算后发现在弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBC）、尿路上皮膀胱癌（BLCA）和肾透明细胞癌（KIRC）中APOBEC3G的mRNA表达量最高。
由于免疫细胞中也会大量表达APOBEC3，Faltas团队通过CCLE数据库中的数据确定了在癌细胞系中APOBEC3G mRNA表达显著增加，排除了肿瘤浸润免疫细胞可能对APOBEC3G mRNA表达量产生的影响。
不同癌症患者肿瘤样本中APOBEC3G mRNA表达量
同时，他们对不同类型癌症的肿瘤样本中归因于APOBEC3G的突变数量进行了估计，发现15%的BLCA的肿瘤样本具有APOBEC3G相关突变特征。而且，CCC、CCT和TCC基序中的C>T的取代中位数与APOBEC3G mRNA表达量的中位数显著相关（R=0.49，P=0.02）。
为了了解APOBEC3G诱导的突变对临床结局的影响，Faltas团队在BLCA患者队列里筛选出具有APOBEC3G突变特征的亚组（CCC+CCT+TCC基序中C>T），以及其他APOBEC突变特征亚组（TCW基序中C>T）进行生存率分析。结果发现相比对照，APOBEC3G突变特征亚组的患者生存率显著降低（P=0.0009)。
BLCA不同亚组患者的生存期
总的来说，Faltas团队通过转基因小鼠模型的直接实验证据，以及TCGA数据库中人类癌症样本数据分析，发现APOBEC3G可促进癌细胞基因组发生突变，以增加癌症异质性，加速恶化过程。此研究结果为未来研发以APOBEC3G为靶点的癌症治疗方法提供了线索。
需要注意的是，作者指出，由于化学致癌物BBN对雄性小鼠作用更明显，所以本研究中仅使用雄性小鼠进行实验。APOBEC3G在膀胱癌中的作用是否具有性别特异性还需要进一步研究。此外，在小鼠上观察到的APOBEC3G的突变特征由于物种的差异，可能并不能完全代表其在人体中的突变特征。
参考文献：
1. Sheehy AM, Gaddis NC, Choi JD, et al. Isolation of a human gene that inhibits HIV-1 infection and is suppressed by the viral Vif protein[J]. Nature. 2002, 418(6898):646-50.
2. Roberts SA, Lawrence MS, Klimczak LJ, et al. An APOBEC cytidine deaminase mutagenesis pattern is widespread in human cancers[J]. Nat Genet. 2013, 45(9):970-6.
3. Liu W, Newhall KP, Khani F, et al. The cytidine deaminase APOBEC3G contributes to cancer mutagenesis and clonal evolution in bladder cancer[J]. Cancer Res. 2022, CAN-22-2912.
