胶质母细胞瘤（glioblastoma, GBM）是成人中最常见也最致命的原发性脑肿瘤，由于药物递送问题以及特征性分子靶标的缺乏，目前对脑胶质瘤的治疗手段仍十分有限[1,2]。
泛素化是蛋白质的一种翻译后修饰，在细胞命运决定、细胞生长和信号转导等方面均发挥着关键作用。蛋白的泛素化是由相应的泛素相关酶催化的，E3泛素连接酶HECTD3与HECT型泛素连接酶同源，近些年的研究结果表明，HECTD3在卵巢癌、乳腺癌和食管鳞状细胞癌中高表达，这表明其在肿瘤发生发展中可能发挥着重要作用。然而，关于HECTD3在GBM中发挥的具体生物学功能目前尚不清楚。
近日，来自西南大学医学研究院的崔红娟教授和来自重庆医科大学的梁平教授合作在British journal of Cancer期刊发表重要研究[3]，阐明了GBM中HECTD3对PARP1多泛素化的催化作用，以及对EGFR介导信号通路的调控作用，这可能为GBM的治疗和诊断提供了一个新的特征性靶点。
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在这项研究中，研究人员首先使用免疫组化（IHC）对5个正常脑组织样本和35个胶质瘤患者样本中的HECTD3表达情况进行了分析，结果表明，HECTD3在这些样本中的表达以分级依赖的方式逐渐增加。
研究人员又对来自CCGA数据库的样本进行了组织学和年龄分布的综合分析，结果表明，HECTD3的表达水平与胶质瘤病理级别高度相关，其中，在大于42岁的IV级GBM患者中表达最高。这些结果综合表明，HECTD3在GBM中的高表达可能与癌症发生有关。
图1 HECTD表达水平与GBM分级密切相关
为了研究HECTD3对GBM的致癌作用，研究人员使用RNAi敲低了GBM细胞系（LN229、U87MG和GBM-3）中HECTD3的表达，并对其增殖、生长、侵袭等过程进行了一系列的综合验证：
① MTT实验表明，敲低HECTD3表达显著抑制了GBM细胞的增殖水平。
② BrdU掺入实验表明，敲低HECTD3表达的细胞系中DNA合成水平显著降低。
③ 平板克隆实验中，与对照组相比，敲低HECTD3表达的细胞克隆形成能力下降。
④ Western Blot对细胞周期相关蛋白的检测表明，敲低HECTD3下调了CDK2和CDK4的表达水平。
⑤ 异种移植实验表明，敲低HECTD3的U87MG细胞的肿瘤生长速率、体积和重量明显降低。
⑥ Transwell和划痕实验表明，敲低HECTD3的LN229和U87细胞迁移能力均发生显著下降，同时Western Blot检测也显示这些细胞中的迁移相关蛋白Slug和MMp2表达下降。
总之，这些结果综合说明HECTD3在GBM细胞的生长、增殖和侵袭等过程中均发挥着关键作用。
图2 敲低HECTD表达水平能显著降低GBM细胞的生长、增殖和侵袭能力
为了探究HECTD3促进GBM增殖的具体机制，研究人员采用了质谱分析的手段分析了HECTD3的互作蛋白，结果表明，HECTD3与多聚ADP核糖聚合酶1（PARP1）间可能存在着直接相互作用。作为存在于核仁中的一种重要分子，PARP1在维持基因组稳定、复制、转录等过程中发挥着关键作用。因此，研究人员推测，HECTD3与PARP1间的相互作用可能是其致癌效应的关键原因。
为了进一步研究HECTD3与PARP1相互作用的结构域，研究人员构建了两种蛋白的各种截短序列。最终，通过在HEK293细胞中进行的瞬时共转染实验，研究人员证实，HECTD3的DOC结构域与PARP1的DNA结合结构域（DBD）之间发生了直接的相互作用。
图3 HECTD3通过DOC结构域与PARP1的DBD结构域发生相互作用
确定了HECTD3可能的作用分子后，研究人员又进一步对其具体的调控机制进行了研究。Western Blot和qRT-PCR检测表明，在HECTD3敲低的GBM细胞系中，PARP1蛋白的表达减少，而被降解的PARP1蛋白产物发生了相应的增加。同时，敲低HECTD3的GBM细胞系中PARP1的mRNA水平并没有明显变化。这些结果表明，HECTD3可能是通过调控细胞内PARP1的稳定性来调节其在细胞中的水平。
为了分析这种调节作用与HECTD3的泛素化酶作用之间的联系，研究人员进行了更进一步的分析。通过抑制蛋白酶体降解多泛素化蛋白的通路，研究人员发现，敲低及过表达HECTD3的GBM细胞系，泛素化水平分别降低和升高。另一方面，使用从头蛋白合成抑制剂CHX处理后，在过表达HECTD3的LN229细胞中PARP1的降解率变慢。这些结果表明，HECTD3是通过影响PARP1的泛素化水平从而调控其稳定性的。
图4 HECTD3通过调节PARP1的多泛素化水平来调控其稳定性
根据泛素蛋白上进行连接的具体赖氨酸位点，泛素化可分为K6、K11、K27、K29、K33、K48和K63等各种类型。在这之中表征最多的多泛素化类型是通过K48或K63位点连接发生的，一般来说，K48连接导致的多泛素化会导致蛋白酶体介导的蛋白质降解，而K63产生的多泛素化则与其它细胞过程有关。
最近的研究表明，HECTD3可以催化STAT3、caspase-8、caspase-9等蛋白上发生的非K48连接多泛素化。为了对HECTD3催化PARP1的具体泛素化类型进行分析，研究人员构建了不同赖氨酸位点发生突变的泛素蛋白载体（K6R、K11R、K27R等等），通过与带有标签的HECTD和PARP1质粒共转染，研究人员发现，HECTD3介导了PARP1的K63连接的多泛素化。另外，将多泛素化催化位点（Cys823）突变后的HECTD3转染到细胞中后，PARP1的多泛素化水平显著降低。
图5 HECTD3调节PARP1的K63连接型多泛素化
为了进一步确定PARP1的具体泛素化位点，研究人员还对预测的底物赖氨酸位点进行了突变，分别构建了K209R、K221R、K548R、K579R和K667R五个PARP1突变体。结果表明，在209号和221号赖氨酸位点发生突变后，PARP1的多泛素化程度发生了显著降低。
图6 PARP1的多泛素化位点位于209号和221号赖氨酸
跨膜受体表皮生长因子受体（EGFR）是一种具有酪氨酸激酶活性的跨膜受体蛋白，研究表明，EGFR在大约30%-40%的GBM患者中高表达，且这种异常表达促进了GBM的增殖、侵袭和复发等关键过程。有研究表明，PARP1的失活对于EGFR信号通路激活有抑制作用，因此，研究人员们推测HECTD3可能能通过调控PARP1的多泛素化来调控EGFR介导的信号通路。
为了验证这一假设，研究人员使用Western Blot检测了敲低HECTD3的LN229和U87MG细胞中相关蛋白（EGFR、P-EGFR和P-AKT）的表达。结果发现，在敲低细胞系中，三种蛋白的表达水平均发生下降；而在敲低HECTD3且过表达PARP1的细胞系中，这种下降被消除。这些现象在随后进行的MTT实验、克隆形成实验和小鼠肿瘤模型上也均得到了验证。
这说明，HECTD3确实通过对PARP1多泛素化过程的调控影响了下游EGFR信号通路的激活。
图7 HECTD3能通过调控PARP1的稳定性进而影响下游EGFR通路的激活
总之，这项研究探究了HECTD3对PARP1的多泛素化调控作用，由于PARP1在肿瘤中作用的多效性，HECTD3有可能为GBM在内的脑肿瘤的治疗提供新的有效靶点。希望未来对HECTD3功能的进一步阐明及相关靶向药物的进一步实验能为更多GBM患者带来福音。
参考文献：
[1]Stupp R, Mason WP, van den Bent MJ, et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma.N Engl J Med. 2005;352(10):987-996.
[2]Perry JR, Laperriere N, O"Callaghan CJ, et al. Short-Course Radiation plus Temozolomide in Elderly Patients with Glioblastoma.N Engl J Med. 2017;376(11):1027-1037.
[3]Zhang G, Tan R, Wan S, et al. HECTD3 regulates the tumourigenesis of glioblastoma by polyubiquitinating PARP1 and activating EGFR signalling pathway [published online ahead of print, 2022 Sep 10].Br J Cancer. 2022;10.1038/s41416-022-01970-9.
