【资料图】
果蝇卵巢生殖干细胞(germline stem cell,简称GSC)是干细胞生物学研究的理想模型【1】,其增殖与分化受细胞内在调控因子和微环境信号共同作用。许多参与调控GSC的内源基因与哺乳动物干细胞发育相关基因,在功能上具有很高的同源性。野生型果蝇卵巢是由32-40个卵巢小管构成,每个卵巢小管的生殖腺前端仅有2-3个GSC。由于野生型果蝇卵巢GSC数量稀少,在单细胞水平分离、纯化GSC,构建生殖细胞图谱和研究GSC细胞特异转录特征变得困难重重。
2023年8月21日,华南农业大学植物保护学院钟国华教授团队在EMBO Reports上发表了题为Single-cell RNA sequencing identifies eggplant as a regulator of germ cell development in Drosophila的研究成果。
研究人员首先利用单细胞转录组测序(scRNA-seq)对野生型果蝇卵巢进行研究,分析得到24个不同细胞亚群的单细胞转录组图谱。结合marker基因表达模式和拟时序分析,进一步对生殖细胞群进行合并和筛选,最终获得6类生殖细胞亚群:GSC、未分化生殖细胞群-1、未分化生殖细胞群-2、早期滋养细胞,卵细胞和末期滋养细胞。利用生信分析(SCENIC分析、GO/KEGG富集分析)和RNAi筛选,构建GSC维持和分化的潜在基因调控网络。随后,作者利用原位杂交和免疫组化实验,鉴定出9个新GSC特异表达marker基因和1个合胞体(cyst)标记基因。研究发现,在转录和蛋白水平上,eggplant(eggpl)特异表达于早期未分化生殖细胞(GSC/CB)中, 并且主要在GSC中高表达。有趣的是,eggpl在幼虫和成虫阶段的雌/雄虫生殖腺前端也高表达。功能上,eggplRNAi或纯合突变引起的基因表达下调,会显著增加2-cell,4-cell,8-cell cysts数量并加速这些细胞的细胞周期。eggpl表达下调能够显著促进卵子形成,导致卵巢体积增大。这些结果表明,eggpl对调控早期生殖细胞分化具有重要意义。富含酵母的培养条件下,果蝇卵巢eggpl表达量显著降低,cysts细胞的细胞周期速率显著增加,卵巢体积也显著增加(图1)。因此,推测eggpl可能是一种参与营养信号转导的生殖细胞内在信号分子。
(图1)不同营养条件对eggpl表达量,cysts细胞周期和卵巢发育的影响
为了验证eggpl是否参与Insulin信号通路调节GSC增殖分化,研究人员利用Gal4/UAS系统特异驱动Dp110CA或Dp110DN进而调节PI3K(一种Insulin信号正调节因子)在生殖细胞的活性。研究发现,过表达Dp110CA能够显著增加BrdU+cysts细胞数,此结果与在富含酵母的培养条件下,果蝇卵巢cysts细胞表型一致。然而,过表达Dp110DN能够显著减少BrdU+cysts细胞数。有趣的是,eggpl下调表达能够抑制过表达Dp110DN引起的BrdU+cysts减少。这些结果表明,eggpl可能是PI3K的下游调控因子。与此同时,研究还发现,不论在富含酵母的培养条件下或标准培养条件下,过表达Dp110DN均能显著增加Eggpl的蛋白表达量,而过表达Dp110CA均能显著减少Eggpl的蛋白表达量。综上所述,eggpl作为Insulin信号通路的下游调控因子参与调控GSC增殖分化过程(图2)。
(图2)PI3K调节eggpl表达验证及eggpl调控GSC分化模式图
本研究的意义:1.揭示了果蝇卵巢早期生殖细胞系在单细胞转录水平的分化发育特点,分析获得的GSC单细胞转录组数据为生殖细胞生物学研究提供重要参考资源;2.首次报道eggpl的表达模式和eggpl突变卵巢表型特征,创新性提出eggpl可能作为Insulin通路下游靶标因子参与调节GSC分化的新模式。
本论文工作主要由华南农业大学植物保护学院博士研究生孙智鹏(论文第一作者)完成,加州大学旧金山分校医学院Todd. Nystul教授和华南农业大学植物保护学院钟国华教授为论文共同通讯作者。
原文链接:https://doi.org/10.15252/embr.202256475