脆性 X 综合征（fragile X syndrome，FXS），是一种 X 连锁显性遗传病，其发病率仅次于唐氏综合征，在男性中的发病率约为 1/4000，女性约为 1/6000~8000，男性发病率高于女性。
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FXS 是引起遗传性智力低下和孤独症谱系障碍最为常见的单基因遗传病，其临床特征主要表现为中度至重度智力障碍、行为语言障碍，甚至癫痫等。针对 FXS，目前尚无有效治疗手段，虽然行为干预和语言训练对于一些轻症患者能够起到病情缓解作用，但就整体而言该病预后较差。
近日，来自麻省大学陈医学院的研究人员，开发的一种反义寡核苷酸治疗方法可以恢复从 FXS 患者身上采集的细胞样本中脆性 X 智力低下蛋白（FMRP）的产生，有望进一步开发成为治疗 FXS 的潜在疗法。目前，这项研究已经以“Antisense oligonucleotide rescue of CGG expansion–dependent FMR1 mis-splicing in fragile X syndrome restores FMRP”为题发表在PNAS上。
（来源：PNAS）
“这项发现为缓解和治疗脆性 X 综合征带来了真正的希望，并且有望能够比我们预计的更快的速度转化为临床应用。”该论文通讯作者、麻省大学陈医学院Joel Richter教授表示，“选定了一项好的基础科学研究，相信得到的数据并且遵循它，最终结果就有可能会改变我们对生物学和疾病的基本理解。”
Joel Richter在美国亚利桑那州立大学获得博士学位，目前他是麻省大学陈医学院分子医学教授，Arthur F.Koskinas 神经科学教授。现阶段，他实验室的研究主要围绕细胞质多聚腺苷酸化对 mRNA 翻译控制的分子生物学以及这个过程对于一些生物学现象的影响，包括动物早期发育、细胞衰老/生长、神经元突触可塑性、学习和记忆、神经系统疾病等。
▲图｜麻省大学陈医学院 Joel Richter 教授（来源：UMass Chan Medical School）
发现剪接错误导致一种关键蛋白缺失
先前研究表明，脆性 X 综合征由位于 X 染色体的FMR1（脆性 X 信使核糖核蛋白 1）基因突变所致。
具体而言，FMR1 基因 1 号外显子上的 5’非翻译区（UTR）有一段 CGG 三核苷酸串联重复序列，由于CGG 三核苷酸重复扩增的动态突变和异常甲基化，造成其编码的脆性 X 染色体智力低下蛋白（FMRP）合成减少或缺失，从而导致脆性 X 综合征。
显微镜观察发现，含有重复扩增的 FMR1 基因呈狭窄带状，夹在 X 染色体的一个臂的顶端，由于这一部位易发生断裂，被称为“脆性位点”。
▲图｜相较于正常 X 染色体，脆性 X 突变的 X 染色体具有脆性位点（来源：UMass Chan Medical School）
据了解，FMR1 基因的 CGG 三核苷酸重复序列在正常人群中具有多态性。通常情况下，正常人体 FMR1 基因 CGG 重复次数在 5~45 之间；当重复次数在 46~54 之间称为“变异灰区”，虽然不会致病但是存在扩增风险；当重复次数在 55~200 之间为“前突变”，而当重复次数大于 200 则是“全突变”，临床表现为脆性 X 综合征，并且不论是“前突变”还是“全突变”，携带突变的女性将有一半概率会将变异遗传给下一代。
研究表明，FMRP 蛋白的主要功能是结合多达 1000 余种不同的 mRNA 并抑制其翻译。尽管现阶段尚不完全清楚 FMRP 如何调控 mRNA 翻译，但已知其在突触可塑性和大脑高级功能中发挥关键作用，FMRP 的缺失严重影响神经系统的正常发育。比如在 FXS 患者中，FMRP 的缺失会导致大脑过量产生数百种不同的蛋白质。
在这项研究中，研究人员基于 FXS 患者血液和组织样本并结合儿科、解剖学、神经科学等开展试验。“通过试验并观察各种 RNA 读数，我们惊讶地发现，FMR1 基因在很多 FXS 患者组织中转录，尽管这些白细胞和脑组织细胞没有制造蛋白质，但仍在产生 FMR1 mRNA，其实这是不应该出现的，这让我们开始重新思考这种疾病发生的分子生物学机制。”该论文第一作者、麻省大学陈医学院分子医学助理教授Sneha Shah说道。
▲图｜来自 FXS 患者的白细胞的基因表达变化和 FMR1 RNA 转录本的鉴定（来源：PNAS）
在很多神经系统疾病中，mRNA 的异常选择性剪接会导致基因表达失调。此次，他们发现 mRNA 在 FXS 患者的白细胞和脑组织中也出现了错误的表达和剪接，其表达一种异常剪接的 FMR1 转录亚型，他们将其称为 FMR1-217 RNA。
机制层面，他们发现在 mRNA 被翻译成功能蛋白之前经历了一个剪接的过程，在这个过程中去除了 RNA 的所有非编码区（内含子），并将蛋白质编码区（外显子）拼接在一起。这种选择性剪接能够使单个基因产生不同的 RNA 亚型，由于这些亚型各自包含不同的编码区，因此可以使单个基因制造多种蛋白质。
通过这项研究，他们在 FMR1 基因突变中发现的 CGG 重复序列导致了错误剪接，并在 mRNA 中留下了一个关键的内含子（假外显子）。正是由于这种剪接错误导致 FMRP 蛋白无法被生产，而非此前认为的基因甲基化。基于此，Joel Richter和Sneha Shah推测，“如果把这种错误剪接进行纠正或避免，那么正常 FMRP 蛋白的生产就能够恢复。”
设计 ASO 并计划联合公司开发成新疗法
改变 RNA 剪接的一种方法是构建一个反义寡核苷酸（ASO）。ASO 其实是一个具有互补序列的短 DNA 片段，能够与靶 mRNA 结合，这种结合能够跳过 RNA 上不适当的剪接位点，从而恢复正常的剪接和成熟的 mRNA 形成。值得一提的是，这种策略已经在临床上用于治疗神经肌肉疾病脊髓性肌萎缩症（SMA），同时也正在开展针对其他神经系统疾病的临床试验。
为了设计出一种能够有效针对 FMR1 mRNA 的 ASO，Joel Richter向麻省大学陈医学院生物化学和分子生物技术系的Jonathan Watts博士求助。
作为 ASO 领域专家，Jonathan Watts长期专注于亨廷顿病（HD）和肌萎缩侧索硬化症（ALS）等神经系统疾病的研究，在此次针对 FXS 的新研究中，他设计出了 11 种 ASO，通过试验验证找到了2 种 ASO 的组合，能够成功抑制患者来源细胞中 FMR1 mRNA 的异常剪接，使这些细胞能够产生正常的 FMRP 蛋白。
最终，研究人员通过使用 ASO 将 FMR1-217 RNA 拯救为正常剪接的 FMR1 RNA，从而恢复 FMRP 蛋白水平。
▲图｜以 FMR1-217 为靶点的 ASO 与 5-AzadC 结合可恢复 FXS 患者细胞中的 FMRP 水平（来源：PNAS）
“如果我们使用的是小鼠模型，那我们可能永远不会发现这一点。”Joel Richter指出，“因为小鼠模型根本没有脆性 X 基因，所以没有产生 mRNA，FMR1 mRNA 的错误剪接是一种依赖于 CGG 扩增的基因调节机制，这或许是人类和灵长类动物所独有的。正是因为我们的这项研究是基于人类细胞，所以能够发现这种错误剪接。”Joel Richter 补充说。
现阶段，他和团队希望能够迅速将这一发现尽快转化为临床应用，因为目前 SMA 的治疗方法也是基于类似策略，只不过两者之间的区别为，这项研究是用于治疗 FMR1 mRNA 错误剪接的 ASO 基因序列。
对于临床转化，“这是一个非常令人兴奋的发现，具有很高的治疗潜力。然而，它现在仍处于早期发展阶段，还需要开展大量研究来确定这种 ASO 治疗策略如何有效地恢复 FMRP 蛋白的生产，比如在多少比例的脑细胞中，以及在哪些脆性 X 综合征患者中等等。如果这种 ASO 治疗策略在相当大比例的患者的细胞中获得成功，那么这将会对临床带来积极影响。”这项研究的参与者、芝加哥拉什大学医学中心儿科学系 Berry Kravis 说道。
接下来，该研究团队将与一家企业建立合作关系，这将有助于推动这种 ASO 治疗策略尽快进入临床试验阶段。
