大多数病变都深藏在人体内部，其深度在体表下几厘米到十几厘米不等。目前临床主要采用医学成像技术确定病变的位置，为确定治疗策略、手术计划和手术指导提供信息。例如，在光动力治疗前对病变深度的估计可以帮助确定合适的药物类型、剂量和激光参数。同时，在前哨淋巴结活检时对淋巴结的准确深度估计有利于病灶的识别，缩短手术过程，减少手术中的出血风险。
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迄今为止，光学技术因其实时采集能力、非电离辐射等优势而备受关注。当前，深部病变的无创光学三维成像是临床应用的长期目标。特别地，采用纯光学方法来确定活体环境中的病灶深度是一个关键挑战。
表面增强拉曼光谱（SERS）在这一应用中具有许多优势，其具有窄线宽的指纹光谱，可以明确区分目标光谱和组织背景，具有高通量检测的潜力。透射拉曼光谱技术被开发用于深度SERS检测。透射拉曼光谱是将激光照明区域和信号收集区域分离在样品的对侧，可抑制表层的背景噪声，从而提高深层信号的信噪比。但是，在实现检测的前提下，需要解决一个进一步的问题：如何确定病灶的位置？当前，基于透射拉曼光谱来估计浑浊介质中病灶深度的方法目前也有少量报道。然而这些方法强烈依赖于在同一均质组织中预测模型的预先校准，而对真正的复杂介质，如超厚的非匀质组织与真实活体组织，仍然具有极大挑战性。
此前，上海交通大学生物医学工程学院叶坚教授团队已设计与搭建了一个具有深层检测能力的拉曼检测/成像系统，并成功在安全光照剂量内通过体外14 cm厚的猪肉组织实现了对包埋在其中的纳米探针标记的病灶仿体的检测（In Vivo Surface-Enhanced Transmission Raman Spectroscopy Under Maximum Permissible Exposure: Toward Photosafe Detection of Deep-Seated Tumors. Small Methods, 2023, 7(2), 2201334）。
为解决病灶深度定位的问题，近日，叶坚教授和林俐助理教授带领博士研究生张玉敏在前期研究的基础上进一步提出了一种快速和稳健的方法，利用比率透射拉曼光谱，对生物组织中的SERS病灶仿体的深度进行准确评估（如图1）。相关成果“A rapid and universal method for depth estimation of lesions in heterogeneous tissues via photosafe ratiometric transmission Raman spectroscopy”发表在《VIEW》（2023）。该团队首先从理论上研究了光子在生物组织中传播的衰减，如图2所示，发现：（1）拉曼峰-峰强度比值的自然对数和深度之间存在线性关系；（2）线性关系的斜率可以根据两个波长下拉曼光子的有效衰减系数提前计算出来，截距可以由纯SERS纳米探针的拉曼峰-峰强度比值的自然对数取得；（3）组织厚度、激光束大小、积分时间和激光功率等对线性关系的影响可以忽略。以上的关系表明无需事先了解组织厚度、纳米探针的浓度或拉曼测量参数，可以利用拉曼峰-峰强度比值的自然对数来预测组织中病变的深度。
图2. 均质组织中SERS纳米探针标记病灶的拉曼信号峰-峰比值对数与病灶深度的理论关系
基于上述发现，他们用前期开发的透射拉曼系统和安全的光照剂量，在实验上证实了这种线性关系，并在超厚（3-5 cm）的离体猪脂肪和肌肉组织中实现了SERS纳米探针标记病灶仿体的准确的深度计算，均方根误差低至2.42%。此外，他们还证明了不同的拉曼峰对均具有深度预测的能力，这为选择合适的拉曼峰对来避免背景组织的干扰提供了便利，多个拉曼峰的组合更为预测复杂组织中病变的深度提供了可能。
图3. 异质组织中SERS纳米探针标记病灶的深度预测模型
因此，该团队进一步地研究了上述线性关系在非均质组织中的有效性。他们分析了在异质组织模型中两个拉曼峰强度比自然对数值与病灶深度间的关系，发现该关系曲线在每个组织交界面处都会发生变化，但同一类型的均质组织在不同层的线性模型斜率是一致的，这主要是由两个波长下拉曼光子的有效衰减系数之差决定的（如图3）。根据此发现，考虑到拉曼光谱独特的多峰与窄线宽特征，他们提出可以通过结合多个峰对的数据构建超定方程组，进行非匀质组织中病灶的快速深度预测。利用所构建的方程组深度预测模型，他们成功在5 cm的离体异质组织块中实现了SERS病灶仿体的准确的深度预测，均方根误差为8.35%（如图4）。
图4. 异质组织中SERS纳米探针标记病灶深度的实验预测
最后，该团队从理论上证实了上述深度预测模型在高度非匀质组织中（如真实的体内情况）进行病灶深度预测的可行性。这项技术具有快速、稳健和通用的优势，可以分析复杂生物样本中病变的深度信息，证明了比率透射拉曼引导的病变定位在实际临床应用中的巨大潜力。
论文的第一作者为上海交通大学生物医学工程学院张玉敏博士，上海交通大学生物医学工程学院林俐助理教授和叶坚教授为共同通讯作者。该研究得到了国家自然科学基金委、上海市科学技术委员会、上海交通大学、上海市妇科肿瘤重点实验室的支持。本课题也由上海市教育发展基金会、上海市教委“晨光计划”资助。
