​Protein Cell | 松阳洲组成功开发高效的基于相分离蛋白辅助的CRISPR转录激活工具 热闻

来源:生物探索 | 2023-05-11 09:33:31 |


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CRISPR-Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats-CRISPR-associated proteins)系统已被广泛用于许多不同生物体的基因组工程和转录调控,一系列报道证明基于转录激活因子与CRISPR-Cas系统的效应蛋白融合,可以实现对內源基因的转录激活,并开发出了多种类型的转录激活工具CRISPRa(CRISPR activation)【1-4】。CRISPR特异的转录调控工具可以通过调节基因的表达而不会造成永久性的DNA损伤,不会产生有害突变和脱靶效应。在临床上,其可以通过同时调节多个基因活性来提供更好的治疗效果,弥补基因治疗存在的不足。但以CRISPRa为代表的基因调控平台因为转录激活效率低下,通常需要融合多种蛋白组件,进而导致其大小超过AAV递送系统的包装极限,极大地限制了其在体内基因治疗中的应用。因此,亟待开发作用效果更强、作用元件更简洁的基因转录调控工具。

近年来,相分离对转录的调控研究已经越来越被大家所关注,如转录因子及RNA聚合酶Ⅱ可通过多价互作介导的相分离机制在启动子位点聚集,促进高效的基因转录起始和延伸【5-9】。那么利用CRISPRa系统与相分离蛋白融合,相分离蛋白是否可以通过介导多价互作使CRISPRa在靶位点浓缩聚集,从而实现基因转录的高效激活呢?这是一个值得探讨的科学问题。

近日,中山大学生命科学学院的松阳洲教授团队及微光基因(苏州)有限公司团队在Protein & Cell杂志发表题为CRISPR-assisted transcription activation by phase-separation proteins的文章,首次将dCas9-VPR(VP64-P65-RTA)转录激活系统与相分离蛋白的IDR(intrinsically disordered region)融合, 证明相分离蛋白辅助的CRISPRa系统可以显著提高哺乳动物细胞中內源基因的表达激活效率,并且该系统具有更宽的gRNA设计窗口(转录起始上游>200 bp)及更低的DNA链靶向偏好性,同时也具有较高的靶向特异性。该研究为精准靶向的转录调控工具的开发与优化提供了新思路;开发的高效转录激活工具在大部分靶位点优于现有激活工具,且作用元件更为简洁;在遗传疾病的治疗应用方向有很大潜力。

dCas9-VPR系统单独起作用时, DNA结合位点只能结合有限拷贝数的VPR,但当dCas9-VPR与相分离蛋白融合后,可以通过相分离蛋白介导的弱多价相互作用募集同类蛋白,使靶位点结合的VPR拷贝数极大提高,从而更高效的激活基因表达(图1 A)。因此,研究人员把dCas9-VPR与不同的相分离蛋白融合表达,发现不同的相分离蛋白都能使dCas9-VPR的转录激活效率得到提高(图1 B-C)。其中dCas9-VPR-FUS IDR融合蛋白在不同靶基因中都能有显著转录激活效果,且融合蛋白更小,因此研究人员后续研究集中在dCas9-VPR-FUS IDR融合蛋白,并简称为dCas9-VPRF系统。

图1

随后,研究人员进一步研究了dCas9-VPRF系统的转录激活特性,在不同靶基因的上游设计了多对gRNA并分别检测靶向链和互补链的激活转录水平。与dCas9-VPR进行对比,发现在多个位点中dCas9-VPRF系统的转录激活效率都更高,并且dCas9-VPRF系统具有更宽的gRNA设计窗口(转录起始上游>200 bp)及更低的DNA链靶向偏好性。

为了测试dCas9-VPRF系统与其他高效CRISPRa(SAM, SUN, SPH)系统的差异,研究人员对比了在同一基因位点上各个系统的转录激活效率,发现在大部分检测的位点中dCas9-VPRF系统也具有更高的转录激活效率。

最后,研究人员进一步探究了dCas9-VPRF系统的靶向特异性, 通过表达谱数据分析发现:dCas9-VPRF系统与dCas9-VPR的特异性相当,在高效激活目的基因的同时具有较好的靶向性。

综上所述,该项工作证明了相分离蛋白融合CRISPRa系统可以使转录激活效率进一步提高,为CRISPRa工具的开发提供了新思路。该项研究开发了新型相分离蛋白辅助的转录激活工具dCas9-VPRF,相比现有的CRISPRa系统具有更高的转录激活效率和gRNA设计窗口,且具有较高的特异性。该研究拓展了CRISPRa工具开发与优化的设计思路,开发的高效转录激活工具dCas9-VPRF有望进一步应用在遗传疾病治疗产品中。

松阳洲教授课题组2018级博士生刘嘉琪和副研究员陈昱僖为该论文的共同第一作者,松阳洲教授和梁普平副教授为共同通讯作者,微光基因(苏州)有限公司为合作单位。

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