在一项新的研究中，由诺贝尔奖获得者Stefan Hell领导的马克斯-普朗克医学研究所的科学家们开发出了一种时空精度为1纳米/毫秒的超分辨率显微镜。他们最近推出的MINFLUX超分辨率显微镜的改进版本允许以前所未有的细节水平观察单个蛋白的微小运动：马达蛋白kinesin-1通过消耗ATP沿着微管行走时的步进运动。这一发现强调了MINFLUX作为观察蛋白中纳米级构象变化的革命性新工具的力量。相关研究结果发表在2023年3月10日的Science期刊上，论文标题为“MINFLUX dissects the unimpeded walking of kinesin-1”。
(资料图)
揭开细胞的内部运作需要对单个蛋白的生物化学知识。测量其位置和形状的微小变化是其中的核心挑战。荧光显微镜，特别是超分辨率显微镜（即纳米显微镜）已成为这一新兴领域不可或缺的工具。作为一种最近推出的荧光纳米镜系统，MINFLUX已达到了一到几纳米---小型有机分子的大小---的空间分辨率。但是要使我们对分子细胞生理学的理解更上一层楼，需要在更高的时空分辨率下进行观察。
自从Hell团队在2016年首次推出MINFLUX以来，它已经被用来追踪细胞中荧光标记的蛋白。然而，这些运动是随机的，跟踪的精确度为几十纳米的数量级。他们的研究是第一次将MINFLUX的分辨能力应用于蛋白的构象变化，特别是马达蛋白kinesin-1。为了做到这一点，他们开发了一种新的MINFLUX版本，用于跟踪单个荧光分子。
所有已建立的测量蛋白动态的方法都有严重的局限性，阻碍了他们解决至关重要的（亚）纳米/（亚）毫秒范围的能力。一些方法提供了很高的空间分辨率，低至几纳米，但不能跟踪足够快的变化。另一些方法则具有很高的时间分辨率，但需要用比待研究的蛋白大2到3个数量级的珠子进行标记。由于蛋白的功能可能会受到这种大小的珠子的影响，使用珠子的研究留下了悬而未决的问题。
来自单个分子的荧光
然而，MINFLUX仅需要一种标准的1纳米大小的荧光分子作为附着在蛋白上的标签，因此可以提供研究天然蛋白动态所需的分辨率和最小的侵入性。论文共同第一作者、Hell团队博士生Otto Wolff说，“一个挑战在于建立一种MINFLUX显微镜，它的工作原理接近理论极限，并能屏蔽环境噪音。”他的同事Lukas Scheiderer补充说，“设计不影响蛋白功能但仍能揭示生物机制的探针是另一个问题。”
用于合成激励强度分布的MINFLUX相位扫描器。图片来自Science, 2023, doi:10.1126/science.ade2650。
这些作者如今引入的MINFLUX显微镜可以记录蛋白的运动，其时空精度可达1.7纳米/毫秒。它只需要检测由这种荧光分子发出的大约20个光子。Hell说，“我认为我们正在为研究单个蛋白的动态以及它们在运作过程中如何改变形状揭开新的篇章。MINFLUX提供的高空间和时间分辨率的结合将使得科学家们能够以前所未有的方式研究生物大分子。”
解决生理条件下kinesin-1与ATP的步进运动问题
马达蛋白kinesin-1是在我们整个细胞中运输货物的一个关键角色，该蛋白的突变是一些疾病的核心。kinesin-1实际上是沿着细丝（微管）“行走”的，这些细丝横跨我们的细胞，就像一个街道网络。我们可以把这种运动想象成字面上的“步进（stepping）”，因为该蛋白有两个“头部（head）”，交替改变它们在微管上的位置。这种运动通常沿着形成微管的13根原丝（protofilament）之一发生，并由细胞的主要能量供应者ATP（三磷酸腺苷）的裂解所推动。
这些作者只用一种荧光团来标记kinesin-1，以纳米/毫秒的时空分辨率记录了单个头部的16纳米步骤以及8纳米的子步骤。他们的研究结果证实当kinesin-1的单个头部与微管结合时，ATP被吸收，但是当它的两个头部都结合时，ATP会发生水解。他们还发现这种步进运动涉及kinesin-1的“柄”---这种蛋白中容纳货物的部分---的旋转。MINFLUX的时空分辨率也显示了在每一步初始阶段时的头部旋转。重要的是，这些发现是在使用生理浓度的ATP的情况下得出的，这在此之前是用微小的荧光标签无法做到的。
Hell团队前博士后研究员Jessica Matthias补充说，“我很高兴看到MINFLUX将带领我们前进。它为研究蛋白如何发挥作用增加了另一个层面。这可以帮助我们了解许多疾病背后的机制，并最终促进治疗方法的开发。”（生物谷 Bioon.com）
参考资料：
Jan O. Wolff et al. MINFLUX dissects the unimpeded walking of kinesin-1. Science, 2023, doi:10.1126/science.ade2650.
