放疗和免疫治疗之间一直被认为存在潜在的协同作用。大量临床前证据表明放疗可以影响免疫调控，从而增强免疫治疗的疗效反应[1]。相应地，也有研究显示PD-1和CTLA-4免疫检查点抑制剂（ICB）可同时增强放疗的局部和远处反应[2]。
基于这些潜在的协同作用，在不同的恶性肿瘤中，已有超过500项临床试验探究放疗联合ICB的抗肿瘤效果，然而，绝大部分试验中没有观察到放疗与免疫治疗之间存在积极的相互作用。虽然ICB在放疗后的巩固治疗阶段取得不错的疗效[3]，但是ICB在手术后的辅助治疗阶段也获得成功[4]。因此综合起来看，放疗和ICB之间是否存在特别的协同作用仍未可知。
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所以，目前迫切需要回答的一个关键问题是，放疗和ICB是否可以通过某种形式的联合来进一步提高临床疗效，以及是否存在生物标志物用于挑选联合治疗的获益人群。
为此，来自芝加哥大学放射和细胞肿瘤学部门的Sean P. Pitroda教授领衔的团队设计并实施了一项研究者发起的1/2期、随机临床试验（COSINR研究），评估同步或序贯放疗联合ICB（伊匹木单抗和纳武利尤单抗）作为转移性非小细胞肺癌（NSCLC）一线治疗的安全性和有效性。
近日，该试验的一项关键次要目标的中期分析结果发表于著名期刊Nature Cancer[5]。此项次要目标中，Sean P. Pitroda教授领衔的团队系统地分析了同一病灶治疗前和治疗中配对活检样本的分子特征，展示了单独放疗和同步放疗免疫联合治疗分别的治疗特异性肿瘤内免疫遗传全景变化。
试验发现，同步放疗免疫联合治疗可同时增强照射病灶内和非照射病灶内抗肿瘤免疫反应，而令人意外的是，单独放疗会减少肿瘤内细胞毒性T细胞和适应性免疫反应。
更重要的是，此次分析还发现，相比序贯放疗免疫联合治疗，同步放疗免疫联合治疗可显著提高基线肿瘤非整倍体增加的免疫冷肿瘤患者的生存预后。因此，肿瘤非整倍体增加可作为同步放疗免疫联合治疗获益的生物标志物。
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接下来我们就一起来看看COSINR试验这项次要目标中期分析是如何进行的。
此次中期分析为COSINR试验的1期部分。在这项1期试验中，共37名转移性NSCLC患者被随机分配至同步或序贯多病灶（2-4个）立体定向放疗（SBRT）联合伊匹木单抗和纳武利尤单抗（ipi/nivo）免疫治疗，序贯组中完成SBRT后7天内开始免疫治疗，中位随访17.0个月。
主要目标的分析结果已发表于著名期刊J Thorac Oncol[6]。结果显示，多病灶SBRT联合免疫治疗具有良好的耐受性，且同步相比序贯毒性更低；联合治疗的疗效同样令人鼓舞，中位无进展生存期（PFS）5.8个月，与同为晚期NSCLC一线治疗的CheckMate 227研究中ipi/nivo组相比，客观缓解率44% vs 36%，1年总生存率84% vs 62%，2年总生存率62% vs 40%。
根据这项次要目标的设计，研究团队对同一个照射病灶进行治疗前和治疗中的配对活检，治疗中活检的时间在序贯组为完成SBRT后1周内免疫治疗开始前、在同步组为完成SBRT和一周期ICB后1周内。
图1. COSINR研究设计示意图（1期部分）
研究团队对活检所得新鲜肿瘤组织进行DNA全外显子测序（WES）用于人类白细胞抗原（HLA）分型、突变和拷贝数变异（CNV）分析、新抗原预测和肿瘤细胞占比（CCF）计算等，同时进行总RNA测序（RNA-seq）用于T细胞受体（TCR）克隆分型、转录本丰度分析、细胞通路分析和免疫特征分析等。
通过组织病理和测序分析对37名患者进行质控筛选。最终，序贯组vs同步组依次有：18人 vs 16人基线组织病理合格→12人 vs 10人治疗前活检DNA测序合格→8人vs 10人治疗后活检DNA测序合格→8人 vs 7人治疗前和治疗中RNA测序均合格。
图2. 患者选择和数据分析框架的Consort流程图
Sean P. Pitroda教授的研究团队观察到，无论所有37名患者中，还是分子检测合格的22名患者中，序贯组和同步组的PFS和总生存期（OS）在现有随访期内均无差异。
在这种情况下，研究团队试图探究，是否存在一个特定分子特征的患者群体，对序贯或同步放疗免疫联合治疗呈现出不同的生存获益。
首先，研究团队对比了治疗前和治疗中DNA测序均合格的18名患者的突变变化。同步SBRT+ipi/nivo治疗后，突变克隆全部或几乎全部消失，提示病理完全缓解或接近完全缓解，这与相应病理切片中TTF1+/CK5+的肿瘤细胞显著减少相吻合。与之相比，序贯组单独SBRT治疗后，大量的突变克隆依然存在，相应病理切片中肿瘤细胞减少也不明显。
同时，肿瘤突变负荷（TMB）和非整倍体评分（染色体臂存在扩增或缺失的比例）在同步SBRT+ipi/nivo治疗后均显著降低，这反映了肿瘤组织二倍体化和肿瘤细胞占比减少。也就是说，突变种类和频率降低是由肿瘤细胞被清除、且免疫细胞进入并富集于肿瘤组织内造成的，而不是肿瘤细胞遗传不稳定性减弱造成的。
由此可见，同步SBRT+ipi/nivo治疗后肿瘤组织内呈现明显的抗肿瘤免疫反应，而序贯组单独SBRT治疗后未观察到抗肿瘤免疫反应。
图3. 同步SBRT+ipi/nivo治疗前后和序贯组单独SBRT治疗前后的突变克隆变化
接下来，研究团队对比了治疗前和治疗中的RNA-seq测序结果。同步SBRT+ipi/nivo治疗显著上调抗原提呈、干扰素反应、IL-6/JAK/STAT3、细胞因子和趋化因子炎症信号、效应T细胞功能等免疫相关通路。而单独SBRT治疗显著下调这些免疫相关通路。相应的，间质细胞评分（ESTIMATE算法）、免疫细胞评分（xCell算法）在同步SBRT+ipi/nivo治疗组均显著增加。分析还显示，同步SBRT+ipi/nivo治疗显著降低剩余肿瘤细胞的增殖活性，而单独SBRT治疗后剩余肿瘤细胞的增殖活性未见减弱。
图4. 同步SBRT+ipi/nivo治疗和序贯组单独SBRT治疗分别的转录组改变
有意思的是，TCR分析（MiXCR算法）发现，虽然前后两次活检相比两组的TCR多样性总体都没有改变，而且两组都有绝大多数（序贯组SBRT为94.5%，同步SBRT+ipi/nivo为95.5%）治疗前TCR被治疗清除。但是，序贯组SBRT治疗后新增的TCR不足治疗前的2/3（新增401个/治疗前641个），而同步SBRT+ipi/nivo治疗后新增的TCR是治疗前的2倍多（新增764个/治疗前398个）。这说明，ICB促使大量新的T细胞进入肿瘤微环境中，而单纯SBRT则不能。
RNA-seq测序分析结果在相应病理切片多重免疫组化染色结果中得到了证实。同步SBRT+ipi/nivo治疗后的瘤内CD8+T细胞密度与治疗前保持一致或有所上升，而序贯组SBRT治疗后大多数患者瘤内CD8+T细胞密度下降。
上述结果表明，相比单独SBRT，同步SBRT+ipi/nivo可更有效地清除肿瘤细胞，并放大适应性抗肿瘤免疫反应。单纯SBRT或可导致基线存在的瘤内CD8+T细胞消失，而SBRT+ipi/nivo则引起新的CD8+T细胞浸润、活化，与基线瘤内CD8+T细胞构成此消彼长的更替平衡。
图5. 多重免疫组化显示治疗前和治疗中瘤内CD8+ T细胞密度
最后，结合这些DNA和RNA测序分析结果，Sean P. Pitroda教授的研究团队探究是否存在特定人群能更多获益于SBRT+ipi/nivo联合治疗。
他们发现已知的ICB疗效预测生物标志物，PD-L1、TMB、新抗原量、T细胞γ干扰素通路活性等，均不能预测SBRT+ipi/nivo所有37名患者以及序贯、同步各组内患者的PFS或OS。同时，也不存在特定的突变、特定的基因水平或染色体臂水平的CNV与PFS或OS相关。
研究团队注意到，近期有研究报道肿瘤非整倍体增加与ICB疗效减弱相关[6]，本研究的生存分析也显示，序贯SBRT+ipi/nivo组中，治疗前肿瘤非整倍体增加与更短的PFS、OS独立相关。但是，活检结果显示，同步SBRT+ipi/nivo组中，治疗前肿瘤非整倍体增加与治疗中活检的肿瘤细胞占比降低显著相关（Spearman’s相关系数=-0.80，p=0.017），非整倍体评分越高，肿瘤细胞占比降低越多。而序贯组单纯SBRT治疗后肿瘤细胞占比下降不明显，且与治疗前非整倍体评分无相关性（p=0.53）。
图6. 治疗前肿瘤非整倍体评分与同步SBRT+ipi/nivo或单独SBRT治疗后肿瘤细胞占比降低的相关性
于是，研究团队决定详细探究治疗前非整倍体评分与序贯或同步放疗+ICB的疗效关系。在所有患者的治疗前肿瘤活检样本中，非整倍体增加与多条免疫信号通路活化负相关，与间质细胞评分、免疫细胞评分也负相关，并且在PD-L1低表达患者中非整倍体评分更高。
研究团队以非整倍体评分中位值（0.54）把所有患者分为高、低非整倍体评分患者。高非整倍体评分患者中，同步组比序贯组具有明显的PFS和OS生存优势，12个月OS率100% vs 17%，log-rank p=0.025。而在低非整倍体评分患者中，两组PFS和OS无显著差异。同时，高非整倍体评分患者中，同步组比序贯组具有更低的非照射病灶进展风险，也就是说，可能存在更强的远隔效应。
图7. 探索肿瘤非整倍体评分作为SBRT和ICB联合治疗的生物标志物。
至此，Sean P. Pitroda教授的研究团队终于初步回答了是否需要以及如何联合放疗和免疫治疗的问题。对于肿瘤非整倍体增加的患者，同步放疗联合ICB疗效优于序贯放疗联合ICB，而且这类患者具有很多免疫治疗预后不良的基线特征，同步放疗联合ICB可以使这类患临床获益最大化。研究团队应用另外两个独立队列验证了该结论。
总的来说，这项研究首次发现，肿瘤非整倍体增加的患者可从同步放疗联合ICB中额外获益，并系统对比了单纯放疗和同步放疗联合免疫治疗分别的肿瘤免疫遗传全景改变。但是，较小的样本量一定程度上减弱了该研究的统计学效能。尽管如此，这项研究的发现可为制定个体化的NSCLC患者放疗和ICB联合方案提供指导框架，并有望推广至其他肿瘤。
研究观察到同步放疗免疫联合治疗可同时增强照射病灶内和非照射病灶内抗肿瘤免疫反应，令人意外的是，单独放疗会减少肿瘤内细胞毒性T细胞和适应性抗肿瘤免疫反应。期待更多来自患者的临床数据和生物学证据，以便优化放疗和ICB的联合治疗方案，包括放疗的放射剂量、分割方式、时机、靶器官的选择、ICB的种类和剂量等。
参考文献：
[1]. Weichselbaum RR, Liang H, Deng L, Fu YX. Radiotherapy and immunotherapy: a beneficial liaison?. Nat Rev Clin Oncol. 2017;14(6):365-379. doi:10.1038/nrclinonc.2016.211
[2]. Arina A, Gutiontov SI, Weichselbaum RR. Radiotherapy and Immunotherapy for Cancer: From "Systemic" to "Multisite". Clin Cancer Res. 2020;26(12):2777-2782. doi:10.1158/1078-0432.CCR-19-2034
[3]. Antonia SJ, Villegas A, Daniel D, et al. Overall Survival with Durvalumab after Chemoradiotherapy in Stage III NSCLC. N Engl J Med. 2018;379(24):2342-2350. doi:10.1056/NEJMoa1809697
[4]. Kelly RJ, Ajani JA, Kuzdzal J, et al. Adjuvant Nivolumab in Resected Esophageal or Gastroesophageal Junction Cancer. N Engl J Med. 2021;384(13):1191-1203. doi:10.1056/NEJMoa2032125
[5]. Spurr LF, Martinez CA, Kang W, et al. Highly aneuploid non-small cell lung cancer shows enhanced responsiveness to concurrent radiation and immune checkpoint blockade [published online ahead of print, 2022 Nov 28]. Nat Cancer. 2022;10.1038/s43018-022-00467-x. doi:10.1038/s43018-022-00467-x
[6]. Davoli T, Uno H, Wooten EC, Elledge SJ. Tumor aneuploidy correlates with markers of immune evasion and with reduced response to immunotherapy. Science. 2017;355(6322):eaaf8399. doi:10.1126/science.aaf8399
