癌症的细胞免疫治疗，又往前迈出了一大步！
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近日，由PACT Pharma的Stefanie J. Mandl和Susan P. Foy，以及加州大学洛杉矶分校的Antoni Ribas领衔的研究团队，完成了一项壮举！
他们使用CRISPR/Cas9基因编辑系统，在T细胞中插入了能够识别肿瘤特异性新抗原的T细胞受体（neoTCR）基因[1,2]，构建了neoTCR-T细胞。首个1期临床数据表明，neoTCR-T细胞治疗安全性良好，可以在一定程度上控制难治性肿瘤的生长。
据了解，这是全球范围内首次通过CRISPR基因编辑技术在T细胞中插入基因，以达到个性化抗癌的目的。这一重磅研究成果发表在顶级期刊《自然》上[3]。
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在该研究中，研究人员对总计187名接受登记的志愿者进行了样本提取，排除掉存在组织和外周血取样失败等原因的志愿者之后，剩余的88例患者进入到了neoTCR的鉴定与发现阶段。
经过进一步地筛选（排除掉TCR分离失败以及TCR不符合产品选择标准的患者），共计46名患者满足neoTCR筛选标准。最后，研究人员对28名患者进行了血液单采，并对其中的16名难治性实体瘤患者（包括结直肠癌、乳腺癌和肺癌）进行了neoTCR-T治疗。
临床患者筛选及治疗流程
总的来说，neoTCR-T治疗的过程可分为两个步骤：①筛选和鉴定肿瘤特异性新抗原（neoTCR）；②提取、改造以及回输T细胞。
首先，研究人员对16名患者的活检标本进行了WES和RNA-seq分析，通过与参考基因组比对，鉴定出了31个到488个不等（中位数为102个）的错义体细胞突变，以及20个到236个不等（中位数为35个）的表达突变。
然后，结合PACT Pharma公司专有的生物信息学算法，研究人员对可能被T细胞识别的新抗原肽-HLA复合体结构进行了预测和优先级排序。
通过将上述步骤中筛选得到的新抗原肽与β2微球蛋白（HLA分子的轻链结构域）及HLA重链蛋白进行融合表达，研究人员生成了能够模拟天然抗原-HLA复合物的三聚体靶标蛋白。随后，通过对这些三聚体单链蛋白进行条码标记（为了后续的单细胞分析）、荧光标记以及多聚化，研究人员针对每名患者生成了一个新抗原-HLA靶标文库（数量从459个到262个不等，中位数为104个）。
为了验证文库中新抗原肽的有效性，研究人员进行了进一步的实验。具体来说，研究人员从患者外周血中提取CD8+T细胞，并将其与上述构建的新抗原-HLA文库共孵育，再使用超灵敏、高通量的纳米颗粒分离技术进行分析，最终验证了共计84个新抗原肽的有效性。
neoTCR-T疗法的技术路线
在筛选到合适的新抗原作用靶标后，研究人员就要改造T细胞了。他们采用电穿孔的转染方法，将Cas9蛋白和sgRNA直接导入由患者血液分离出的T细胞中。
在这一步，sgRNA能够一次性引导Cas9完成两步操作：①将T细胞内源性的TCR基因（负责编码TCR蛋白α链的TRAC基因和编码β链的TRBC基因）敲除掉；②将针对每位患者所挑选出来的最多三个neoTCR基因（上述新抗原肽验证阶段中效果最佳的候选TCR）插入到TRAC基因位点。
在临床研究阶段，研究人员采用了三个剂量梯度的neoTCR-T细胞进行回输治疗，并对其中两个剂量水平设置了额外进行IL-2处理对照组（IL-2可提高T细胞活性并促进其生长）。
结果表明，经回输治疗后，患者外周血中neoTCR细胞占比升高，且这种升高水平存在剂量效应。另外，接受额外IL-2治疗的患者，体内neoTCR的比例显著高于未进行IL-2治疗的患者，这表明，联合使用IL-2可能是提高neoTCR-T疗效的有效手段。
回输治疗后患者体内neoTCR-T细胞比例存在剂量效应
为了证明改造后的neoTCR-T细胞能够有效运输到肿瘤组织，研究人员对患者活检组织中neoTCR的互补决定区3（CDR3）序列进行了定量分析，结果表明，多名患者肿瘤部位的neoTCR比例均得到显著提高，其频率均高于回输治疗之前天然TCR的水平。
最后，研究人员对TCR-T治疗的毒性和疗效进行了综合分析。研究结果表明，一例患者出现了1级细胞因子释放综合征，一例出现了3级脑炎的症状，所有患者都产生了淋巴细胞消耗所导致的预期副作用。
从疗效来看，5名患者的病情稳定，余下11名患者疾病进展。另外，16名患者中有两名患者的肿瘤尺寸变小。
治疗后有两名患者的肿瘤变小
作为肿瘤细胞具有的独特性质，肿瘤新生抗原的表达为肿瘤治疗提供了理想的靶点，另一方面，免疫疗法精确的靶向性、高效的杀伤力以及高度定制化的能力也为我们提供了有效的治疗工具。
在这个研究中，研究人员通过使用高效的新生抗原筛选平台以及工程化细胞改造平台，让个性化TCR-T治疗从概念变为现实。虽然临床研究数据表明疗效有限，但仍证明了这种治疗策略是可行的。
参考文献
[1] Schumacher TN, Schreiber RD. Neoantigens in cancer immunotherapy.Science. 2015;348(6230):69-74. doi:10.1126/science.aaa4971
[2] Gros A, Parkhurst MR, Tran E, et al. Prospective identification of neoantigen-specific lymphocytes in the peripheral blood of melanoma patients.Nat Med. 2016;22(4):433-438. doi:10.1038/nm.4051
[3] Foy SP, Jacoby K, Bota DA, et al. Non-viral precision T cell receptor replacement for personalized cell therapy.Nature. doi:10.1038/s41586-022-05531-1
